不同抗癲癇藥物在戊四唑(PTZ)誘導斑馬魚癲癇模型中的藥效學分析

摘要：目的探討卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉三種抗癲癇藥物在戊四唑（PTZ）誘導斑馬魚癲癇模型中的作用。方法在斑馬魚PTZ誘導癲癇模型中，選擇卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉三種抗癲癇藥物，并采用3個不同的濃度進行藥效評價和行為學分析。結果與溶劑組相比，卡馬西平300μM濃度組能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率分別為95.1%（P<0.01）；100 μM濃度組快速運動距離反而比溶劑組增加130.1%（P<0.01）；30μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。與溶劑組相比，苯妥英鈉1000μM濃度組能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率為85.9%（P<0.01）；300μM濃度組也顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率為55.0%（P<0.01）；100μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。與溶劑組相比，丙戊酸鈉3000 μM濃度組能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率分別為62.6%（P<0.01）；1000、300μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。結論卡馬西平在300μM濃度時對癲癇發作有治療作用，而在100μM濃度時能加重癲癇發作；苯妥英鈉和丙戊酸鈉治療癲癇量效關系明確。

關鍵詞：卡馬西平；苯妥英鈉；丙戊酸鈉；斑馬魚；癲癇藥物篩選是新型藥物研發過程中一個重要的環節，而篩選模型在藥物篩選過程中起著關鍵性作用[1，2]。面對大量的樣品，利用斑馬魚藥物篩選動物模型能夠快速、準確的實現大量樣品活性評價，從而篩選到少量活性成分[3，4]。癲癇是慢性反復發作性短暫腦功能失調綜合征。以腦神經元異常放電引起反復癇性發作為特征[5，6]。卡馬西平，苯妥英鈉和丙戊酸鈉是常用的抗癲癇藥物，能降低神經細胞膜對Na+和Ca2+的通透性，從而降低細胞的興奮性，延長不應期，也可能增強GABA的突觸傳遞功能[7-9]。但三種藥物在PTZ誘導斑馬魚癲癇模型中的具體作用和機制尚不清楚。本實驗通過建立斑馬魚癲癇模型，探討卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉三種抗癲癇藥物的藥效分析，為臨床應用提供一定的實驗依據。

1資料與方法

1.1一般資料 斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行。每次交配準備4~5對成年斑馬魚，平均每對能產200~300個胚胎。在受精后6h（即6 hpf）和24 hpf 對胚胎進行清理（移除已死亡胚胎），并根據胚胎的發育階段挑選合適的胚胎。

受試樣品卡馬西平購自ACR ORGANICS 公司，批號AO272746。苯妥英鈉購自北京百靈威科技有限公司，批號GF01-FD。丙戊酸鈉購自美國sigma公司，批號109K1256。三種藥物分別用二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，批號1095515）配制成儲備液，-20℃保存。戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ）購自美國sigma公司，批號069K1245。解剖顯微鏡（SMZ645，Nikon公司）；48/96孔板（Nest Biotech）；行為分析儀（V3，ViewPoint Life Sciences公司）。

1.2方法在 28℃ 條件下用養魚用水孵育胚胎（養魚用水水質：每1L反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導率為 480~510 μS/cm；pH 為 6.9~7.2；硬度為 53.7~71.6 mg/L CaCO3）。選擇卡馬西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉和阿司匹林進行抗癲癇藥效評價，其中阿司匹林作為陰性對照藥物。卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉選擇3個濃度進行藥效評價，阿司匹林選擇10、30、100μM進行實驗。待測藥物先處理1 h，再加入戊四唑，穩定10 min后，利用運動/行為分析儀記錄60 min內斑馬魚的運動情況。對斑馬魚的快速運動（V>20mm/sec）距離（D）進行定量分析，計算藥物的抗癲癇治療效率，公式如下：癲癇治療效率（%）=(1 -■)×100%。每個實驗組均處理8尾斑馬魚。

1.3數據分析與統計學處理實驗數據均用Mean±SE表示。用方差分析和Dunnett's T-檢驗進行統計學分析，P<0.05表明具有顯著性差異。

2結果

2.1卡馬西平的抗癲癇作用如圖1所示，在兩次重復實驗中，與溶劑組相比，卡馬西平300μM濃度組均能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率為分別為94.6%（P<0.01）和95.1%（P<0.01）；100 μM濃度組快速運動距離反而比溶劑組分別增加103.3%（P<0.01）和130.1%（P<0.01）；30μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖1 卡馬西平抗癲癇藥效分析（mean±SE）

2.2苯妥英鈉的抗癲癇作用如圖2所示，在兩次重復實驗中，與溶劑組相比，苯妥英鈉1000μM濃度組均能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率分別為85.8%（P<0.01），85.9%（P<0.01）；300μM濃度組也顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率分別為39.5%（P<0.05），55.0%（P<0.01）；100μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖2苯妥英鈉抗癲癇藥效分析（mean±SE）

2.3丙戊酸鈉的抗癲癇作用如圖3所示，在兩次重復實驗中，與溶劑組相比，丙戊酸鈉3000μM濃度組均能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率分別為73%（P<0.01），62.6%（P<0.01）；1000、300μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖3 丙戊酸鈉抗癲癇藥效分析（mean±SE）

2.4阿司匹林的抗癲癇作用如圖4所示，在兩次重復實驗中，與溶劑組相比，阿司匹林10、30、100μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖4阿司匹林抗癲癇藥效分析（mean±SE）

3討論

實現不合格藥品的早期鑒定是現階段藥物研發工程的重大進步，能加速藥物的研究和發展，并節省不斷增長的開支。與哺乳動物的高度相似性和不斷涌現的驗證性藥理實驗數據表明，斑馬魚具有作為早期檢測藥物副作用模型的潛能[10]。在得到足夠驗證的前提下，斑馬魚能夠在早期對成千上萬種藥物進行快速的藥理安全性檢測，并在藥物篩選的關鍵性階段提供更好的幫助。在兩次重復實驗中，與溶劑組相比，卡馬西平300μM濃度組均能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率達到95.1%（P<0.01）；而100μM濃度組快速運動距離反而比溶劑組增加達到130.1%（P<0.01）。實驗表明，卡馬西平在300μM濃度時對癲癇發作有治療作用，而在100μM濃度時能加重癲癇發作。這種現象讓我們需要思考基因表達與藥效的關聯性。同時卡馬西平加重癲癇失神發作是目前面臨的一個重要的臨床問題[10]，其機制尚未了解。這個現象與卡馬西平100μM在斑馬魚模型加重癲癇發作相一致。在兩次重復實驗中，苯妥英鈉1000μM濃度組均能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率達到85.9%（P< 0.01）；300μM濃度組也顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率達到55.0%（P <0.01）實驗表明，苯妥英鈉治療癲癇量效關系明確，在300~1000μM濃度下能明顯改善癲癇癥。丙戊酸鈉3000μM濃度組均能顯著降低快速運動距離，癲癇治療效率達到73%（P<0.01）；1000、300μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

實驗表明，丙戊酸鈉治療癲癇量效關系明確，在3000μM濃度下能明顯改善癲癇癥狀。阿司匹林10、30、100μM濃度組快速運動距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。實驗結果表明，阿司匹林在10~100μM濃度下對癲癇癥狀無改善作用。

參考文獻：

[1]Peterson， R. T.， Macrae， C. A. Systematic approaches to toxicology in the zebrafish[J]. Annual Review of Pharmacology and Toxicology，2012，52:433 -453.

[2]Hortopan， G. A.， Dinday， M. T.， Baraban， S. C. Spontaneous seizures and altered gene expression in GABA signaling pathways in a mind bomb mutant zebrafish[J]. Journal of Neuroscience，2010，30:13718 -13728.

[3]Baraban， S. C.， Dinday， M. T.， Hortopan， G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment[J]. Nature Communication，2013，4:2410.

[5]Orellana-Paucar， A. M.， Serruys， A. S.， ， et al.Anticonvulsant activity of bisabolene sesquiterpenoids of curcuma longa in zebra?sh and mouse seizure models[J]. Epilepsy Behavior，2012，24:14 -22.

[6]Mussulini， B. H.， Leite， C. E.， Zenki， K. C.，et al.Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization[J]. PLos one，2013，8:1 -9.

[7]Pineda， R.， Beattie， C. E.， Hall， C. W. Recording the adult zebrafish cerebral field potential during pentylenetetrazole seizures[J]. Journal of Neuroscience Methods，2011，200:20 -28.

[8]Wong， K.， Stewart， A.， Gilder， T.， et al.Modeling seizure-related behavioral and endocrine phenotypes in adult zebrafish[J]. Brain Research，2010，1348:209 -215.

[9]Vermoesen， K.， Serruys， A. S.， Loyens， E.， et al.Assessment of the convulsant liability of antidepressants using zebra?sh and mouse seizure models[J]. Epilepsy Behavior，2011，22:450 -460.

[10]Baxendale， S.， Holdsworth， C. J.， Meza-Santoscoy， P. L.， et al.Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures[J]. Disease Models Mechanisms，2012，5:773 -784.

編輯/申磊