PCR及RT-PCR對咽拭子標本肺炎支原體的檢測探究

摘要：目的分析PCR及RT-PCR對咽拭子標本肺炎支原體的檢測結果。方法收集2013年01月~2014年01月本院收治的140例兒科門診患兒臨床資料，其中肺炎支原體患兒68例，疑似肺炎支原體患兒72例，分別采取PCR及RT-PCR方法檢測，最后分析兩種檢測方法的應用價值。結果140例患兒咽拭子標本中共檢測陽性標本18例(12.85%)，共檢測出陽性52例，占37.14%；陰性88例，占62.86%。RT-PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的敏感度明顯高于PCR檢測，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。兩種方法測定咽拭子標本肺炎支原體的特異度對比，差異不顯著，無統計學意義(P>0.05)。在140例兒科門診患兒中，≤３歲組兒童呼吸道感染陽性率為57.86%，明顯高于≤7歲組患兒、>7歲組患兒的30.71%、11.43%，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。結論與PCR檢測方法對比，采取RT-PCR檢測咽拭子標本肺炎支原體，可提高早期臨床診斷的準確性，合理判斷臨床治療效果。

關鍵詞：PCR；RT-PCR；咽拭子；肺炎支原體肺炎支原體(ＭP)作為呼吸感染性臨床疾病中一種常見的病原體，可通過呼吸道傳播原發性非典型肺炎，此疾病發病時期為秋冬季節，發病對象大部分為嬰幼兒，患兒臨床癥狀表現為：持續發熱、咳嗽咳痰等[1]。肺炎支原體診斷大多是通過實驗室的檢查，臨床診斷與流行病學調查作為主要的臨床檢測手段，但在臨床檢測過程中容易受到患兒年齡、病程、機體免疫系統等因素的影響[2]。因此，需要進行雙份血清檢測，才能明確區分近期Mp急性感染。但是，在臨床檢測中難以獲取雙份血清，因此，單份血清抗體檢測只能作為ＭP感染的診斷輔助手段。隨著分子生物學診斷方法的改進，PCR檢測方法在ＭP感染早期臨床診斷中得到廣泛的應用，在20世紀初出現了一種熒光實時定量PCRRT-PCR，此檢測方法加入了特異性較強的探針，在PCR檢測過程中明確大量致病菌的定位。為了分析PCR及RT-PCR對咽拭子標本肺炎支原體的檢測結果，本院采取PCR及RT-PCR方法進行檢測咽拭子標本肺炎支原體，現將結果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集2013年01月~2014年01月本院收治的140例兒科門診患兒臨床資料，其中肺炎支原體患兒68例，疑似肺炎支原體患兒72例，其中男性83例，女性57例，年齡1個月~12歲，平均年齡為(3.55±1.33)歲。

1.2方法

1.2.1標本收集與處理所有患兒均取咽拭子，放置在1.5mlEP管中進行攪拌，棄拭子。進行離心1min，10000r/min，去上清，采取細菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒，取500ul樣本提取DNA，取上清液２Ｌ作為模板。同時，應用PCR、Rt-PCR檢測方法，將75.00ｇKH２PO４0.52ｇ，Na２HPO４1.22g，Ｌ－谷氨酸(glu)0.72gr溶于800ml去離子水中，將PH值調整到7.4，定容到1Ｌ，采取0.2m濾器抽濾除菌分裝，放置在低溫下保存。

1.2.2研究方法PCR參照文獻合成Mp16SrRNA基因擴增引物[3]，終止反應后，1u6×溴酚藍加樣緩沖液加入到5LPCR擴增產物樣品中，在1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳紫外燈下觀察結果。Rt－PCR試劑盒應總體積為50ul，完成反應后，電腦自動采集于分析結果。

1.3診斷標準①治診標準：呼吸道癥狀和或體征Ｘ線胸片不同程度的肺部炎癥表現，單份血清Mp－IgM陽性，大環內酯類抗生素治療顯效。②PCR診斷標準：PCR的擴增產物為277bp，與陽性對照有相同條帶為Mp感染陽性。③Rt-PCRR診斷標準：患兒咽拭子的ＤNA拷貝數1.00e+005coeiesml診斷為Mp感染陽性。

1.4統計學處理本次研究資料均采用SPSS18.0統計學軟件處理，計數資料對比采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 PCR檢測經紫外燈觀察，瓊脂糖凝膠上形成目標片段，其大小約為277bp，即可判斷為陽性。140例患兒咽拭子標本中共檢測陽性標本18例，占12.85%。

2.2 RT-PCR檢測 140例標本共檢測出陽性52例，占37.14%；陰性88例，占62.86%。

2.3對比PCR及RT-PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的敏感度、特異度RT-PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的敏感度為88.24%，明顯高于PCR檢測的8.82%；差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。RT-PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的特異度為95.83%，與PCR檢測的91.67%對比，差異不顯著，無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.4 Mp感染陽性患兒不同年齡段分布結果分析在140例兒科門診患兒中，≤３歲組兒童呼吸道感染81例(57.86%)，≤7歲組患兒感染43例(30.71%)，>7歲組患兒感染16例(11.43%)，各個年齡階段陽性率對比，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。

3討論

隨著分子生物學技術的發展，Mp感染早期診斷準確率不斷提高，特別是16 SrRNA基因序列的特異性較為突出[4]。在本研究中，采取16 SrRNA基因的PCR技術，在咽拭子標本中檢測出Mp-DNA陽性標本18例，占12.85%。主要是Mp感染患兒需要依據血清學檢測，年齡、病程、免疫系統等因素對檢測造成不同程度的影響。因此，在140例兒科門診患兒中，≤３歲組兒童呼吸道感染陽性率為57.86%，明顯高于≤7歲組患兒、>7歲組患兒的30.71%、11.43%，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。

在臨床檢測中，PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的敏感度為8.82%，明顯低于RT-PCR測定的88.24%，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。在Mp-DNA濃度低于1.00ｅ＋0.05copiesml時PCR法可能會出現漏診的情況。與傳統的PCR檢測對比，RT-PCR檢測技術的應用優勢在于具有明顯的特異性、靈敏度較高、重復性良好定位準確等[5]。通過以上研究表明，140例標本利用RT-PCR檢測技術，共檢測出陽性52例，占37.14%；陰性88例，占62.86%。結果顯示RT-PCR咳嗽時間大多集中在0d~3w，與PCR檢測對比，RT-PCR檢測受到病程的影響比較小，因此，針對病程超過10d的患兒，采取RT-PCR檢測，其檢測率更高。

通過以上研究表明，RT-PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的敏感度、特異度分別為88.24%、95.83%；PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的敏感度、特異度分別為8.82%、91.67%，RT-PCR測定咽拭子標本肺炎支原體的敏感度明顯高于PCR檢測，差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)。兩種方法測定咽拭子標本肺炎支原體的特異度對比，差異不顯著，無統計學意義(P>0.05)。可見，在咽拭子標本肺炎支原體的檢測中應用RT-PCR檢測技術，有利于提高患兒早期診斷準確性。

綜上所述，在咽拭子標本肺炎支原體檢測中，全面觀察患兒病情變化，從而采取合適的檢測方法，提高檢測準確率，為及時治療提供個體化、針對性的治療方案，以改善患兒預后情況。

參考文獻:

[1]李淳，吳移謀，朱翠明，等.PCR及RT-PCR檢測咽拭子標本肺炎支原體的比較[J].中國人獸共患病學報，2012，28(2):127-130.

[2]李雙玉.IRS-PCR診斷肺炎支原體肺炎的臨床應用與評價[D].天津醫科大學，2013.

[3]王勇.熒光定量PCR檢測社區獲得性肺炎患者咽拭和痰標本肺炎支原體的研究[D].大連醫科大學，2010.

[4]徐曉剛，劉楊，張泓，等．一種快速同步檢測肺炎支原體及其大環內酯類耐藥突變的新方法[J].中華檢驗醫學雜志，2013，33(9):840-844.

[5]王惠榕，蕭劍雄.肺炎支原體感染的流行病學研究進展[J].中國人獸共患病學報，2010，26(11):1062-1066.編輯/申磊