迷走神經對大鼠肝細胞中NTCP表達作用的研究

摘要：目的本實驗擬通過建立去迷走神經肝支大鼠模型，探討迷走神經對肝細胞功能、狀態及NTCP的表達變化的影響。方法大鼠隨機分為兩組：A組：迷走神經肝支切斷組， B組：假手術組，每組20只。通過HE染色法光學顯微鏡下觀察切斷迷走神經肝支后的肝臟病理形態學改變，分別通過RT-PCR及Western blotting法檢測NTCP的表達變化，來分析迷走神經對其影響。結果去迷走神經組中，肝臟組織NTCP mRNA和NTCP基因表達均隨著術后時間其表達明顯下降。結論在去迷走神經肝支狀態下，肝細胞發生改變，NTCP表達水平減少，進而影響膽鹽因子轉運及表達。

關鍵詞：NTCP ；迷走神經；RT-PCR；Western blotting支配肝臟的神經分布廣泛，肝實質細胞如肝細胞和非實質細胞如Kupffer細胞、肝竇內皮細胞等都被交感神經和副交感神經雙重支配著[1]。國內外的研究表明，支配肝臟的神經在調節肝臟血流的改變，物質代謝以及膽道系統的功能方面均有重要作用。Na+牛磺膽酸鹽同向轉運多肽（NTCP）是肝細胞特有的一種轉運載體，在肝小葉和肝的腺泡均有廣泛分布，膽汁酸鹽4/5的結合型牛磺膽酸被鈉離子依賴性途徑所吸收，最終形成了膽鹽依賴性膽汁流，被稱為重要的膽鹽攝取系統[2]。

1實驗方法

1.1實驗動物與分組 健康Wistar大鼠40只，雌性，清潔級動物，體重200~220 g(佳木斯大學動物實驗中心提供)。大鼠飼養于恒溫清潔環境，喂飼標準飼料，維持12 h晝夜節律。隨機分為以下二組：A組：迷走神經肝支切斷組，B組：假手術組，每組20只。A組距離賁門0.5 cm分出的迷走神經肝支并離斷；假手術組大鼠開腹后探查迷走神經(見照片1)。各組分別在手術后第1，3，5，7，9 d剪取肝組織。分別進行HE染色，觀察肝臟病理形態學的變化。

1.2通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測NTCP mRNA 的表達變化 用Trizol液提取組織mRNA，分光光度法測定RNA的純度，采用RT-PCR技術，以β-actin為內參，引物序列sense 5'-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCA

GC-3'，Antisense 5'-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3'擴增產物片斷大小為121bp；β-actinsense5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'，Antisense 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3?擴增產物片斷大小為241 bp。退火溫度分別為56℃、54.7℃。用凝膠成像系統照像，Bandscan軟件進行圖像分析，結果以目的區帶的光密度值積分/ 內參區帶的光密度值積分表示，作為目的mRNA 的相對含量，進行半定量分析。

1.3 Western blotting法檢測NTCP蛋白水平 模型制作成功后，取材大鼠肝組織并進行總蛋白的提取，利用Pirece公司提供的組織蛋白抽提試劑盒來完成對肝組織的提取，Bradford法測定蛋白濃度后，電泳、轉膜、經一抗、二抗后，通過化學發光法來進行底物顯影，然后用圖像分析儀來檢測X片效果，用Image Pro Plus軟件進行相應蛋白條帶的半定量分析。

1.4統計學分析 統計分析的進行需要應用SPSS 18.0軟件，實驗結果均以均數±標準差（x±s）表示，經雙因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01判定差異就有顯著性，P>0.05，無統計學意義。

2結果

2.1一般情況 大鼠在手術后10~15 min，清醒，站立，3 h后開始進食水。A組（n=20）術后皮毛雜亂失去光澤，活動減少，食欲不振，體重下降，尿量減少、顏色變深，大便顏色變淺。B組（n=20）術后皮毛顏色正常，行動如常，食量以及二便如常。

A組術后9d存活率為80%（16/20），病死的4只中麻醉意外1只，感染死亡1只，全身衰竭2只；B組術后9 d存活率為90%（18/20），病死的2只中，感染死亡1只，出血死亡1只。A組死亡率與B組相比，差異具有統計學意義。（P＜0.05）

2.2去迷走神經肝支術后肝臟病理形態學改變 通過本實驗大體觀察，A組術后肝臟外觀輪廓稍有腫大，表面呈黃褐色，失去光華紅潤的外表，部分可見黃色結節。B組大鼠肝臟輪廓正常，表面呈紅褐色，。HE染色顯示A組大鼠肝小葉結構尚完整，肝細胞腫脹，位于中央靜脈周圍的肝細胞無折光性，棕褐色膽汁色素顆粒沉積，在術后第7、9 d可見，肝細胞內色素顆粒增大顯著，部分肝細胞嗜酸性變及氣球樣變，點狀或灶狀壞死，部分肝細胞脂肪變性。匯管區明顯炎性細胞浸潤，小膽管增生，膽栓形成。B組大鼠鏡下觀察，肝小葉清晰可見，中央靜脈、匯管區結構正常，肝細胞板呈放射狀排列，未見肝實質細胞病變。

2.3 NTCP mRNA的表達變化 結果顯示，A組中NTCP mRNA隨著術后時間其表達明顯下降，半定量提示Pst 5 d時與B組相比即有差異性（P＜0.05)，至Pst 9 d時更加明顯，僅微弱表達，見表1。而B組中NTCP mRNA表達始終處于較高水平。

2.4 NTCP 蛋白的表達變化 Western Blotting 結果顯示，A組Pst1d～9d，肝組織NTCP蛋白表達水平明顯下降，以去迷走神經肝支后第9d最低，蛋白條帶隱約可見，并且不是很完整。B組Pst1d～9d，肝組織NTCP蛋白表達水平并無明顯增高或降低，見圖1，圖2。兩組之間的差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

圖1 NTCP在去迷走神經大鼠肝組織中的表達變化

圖2 NTCP在假手術組大鼠肝組織中的表達變化

3討論

人肝臟的實質細胞和非實質細胞均受交感神經和迷走神經的雙重支配，這些神經在形態學上來說擁有了血管動力、感覺及代謝調節的功能。從實質功能上來說，支配肝臟的自主神經其重要性可以與支配心臟的神經相提并論。支配肝臟的迷走神經傳入神經的主要功能是將滲透壓、壓力感受器等這些與肝臟代謝有關的神經沖動被其傳送到中樞神經系統，故將其稱為感覺神經；支配肝臟的迷走神經傳出神經的主要功能是指肝內的血流動力、膽流和糖脂類物質代謝等都可以被其進行調節，同時肝實質細胞的再生等也都被其所調節，故稱其為運動神經。

肝臟迷走神經起著長期的代謝調節作用，去迷走神經支配的肝臟可表現出對糖原和去甲腎上腺素的代償性超敏感受。這些結果都提示，支配肝臟的迷走神經有著很強大的調節能力。基于此，我們設計了本實驗，首先觀察了去迷走神經肝支對大鼠肝臟形態改變的影響。結果顯示迷走神經離斷后，肝臟外觀輪廓稍有腫大，表面呈黃褐色，失去光華紅潤的外表，部分可見黃色結節。通過光鏡下觀察可見大鼠肝小葉結構完整，位于中央靜脈周圍的肝細胞沒有折光性，發現肝細胞內有膽汁色素顆粒沉積，在術后第7、9 d，可見色素顆粒在肝細胞內明顯變大，有一些肝細胞發生嗜酸性變或者氣球樣變，有一些肝細胞發生壞死主要以點狀或灶狀為主，有一些發生脂肪變性。這樣的結果同時吸引著我們的進一步研究，就是迷走神經是否可以影響轉運子基因的表達和變化，從而影響著肝臟的功能、影響著肝內膽鹽的代謝，并影響了肝臟形態學的改變。

膽鹽的代謝是肝臟的主要功能之一，主要包括攝取、細胞內轉化運輸和向毛細膽管排泄。膽鹽、磷脂和膽固醇等膽汁主要成分的攝取及排泌主要是通過肝膽膜轉運蛋白(HMTs)來完成實現的，NTCP 是最主要的膽鹽攝取蛋白，而BSEP則是最重要的膽鹽輸出蛋白。NTCP作為最主要的膽鹽攝取蛋白，其主要是通過跨膜梯度來實現的，這一梯度值則是通過Na+-K+-ATP酶所產生。

通過本實驗的發現，在去迷走神經肝支大鼠這組中NTCP mRNA，隨著術后時間的延長，其表達明顯下降，半定量提示Pst 5 d時與B組相比即有差異性（P＜0.05)，至Pst 9 d時更加明顯，僅微弱表達；在蛋白水平上進一步證實了上述變化。這些實驗結果都可以提示著迷走神經影響并調節著膽鹽轉運子NTCP和其在肝細胞毛細膽管面上的分布，從而使得膽鹽的攝入被抑制，這充分說明，支配肝臟的迷走神經不僅對肝細胞的形態學有一定影響，而且還影響并調節著肝細胞的功能。因此，在肝臟手術中我們要避免支配肝臟迷走神經的損傷，使得肝細胞功能被有效保護，防止膽鹽轉運子NTCP受損，降低肝內膽汁淤積的發生概率，避免引起肝臟術后不必要的傷害。

參考文獻：

[1]張培林.神經解剖學[M].北京人民衛生出版社，1998:144-166.

[2]吳問漢，楊尹默，黃莚庭.膽道梗阻肝細胞膜Na+/K+-ATP酶的變化[J].中華實驗外科雜志，2003，20(2):120-122.

編輯/肖慧