HIV實驗室檢測方法研究進展

艾滋病毒即人類免疫缺陷病毒，可嚴重破壞人體的免疫系統，誘發嚴重感染及癌癥，發展到最后，將會導致獲得性免疫缺陷綜合癥。到2010年底，聯合國艾滋病規劃署估計全世界范圍內HIV感染者約3400萬，2010年內大約有260萬HIV新感染者，并有180萬人死于AIDS[1]。因此，HIV檢測對于艾滋病的篩查、診斷、病程監控、指導治療方案具有重要的意義。本文將簡述近年來HIV實驗室檢測方法的研究進展，這些檢測方法對于控制艾滋病毒的流行，艾滋病毒感染的診斷、篩查、監測顯得尤為重要。

1HIV感染期間的標志物及其意義

在HIV感染后依次能檢測到病毒RNA，p24抗原，最后是抗體[2]。在感染HIV后2w內（10~12d），血液中病毒RNA數量呈指數級遞增。當HIV感染者發展為AIDS后，機體免疫已不能抑制HIV的復制，病毒RNA數量再次呈指數級上升。因此病毒RNA水平是判斷病毒復制情況以及監控病情發展的重要指標。HIV感染后的11~13d，血液中就可以檢測到p24抗原。p24可作為病毒復制的間接指標。p24水平隨HIV的復制而增加，并在感染后45d內保持在較高水平，但由于其檢測方法較RNA檢測方法靈敏度低，因此p24檢出時間比RNA晚[3]。在感染HIV后的很長一段時間內，不能在宿主體內檢測到HIV特異性抗體，稱為“窗口期”。“窗口期”的長短由病毒的致病性和宿主的免疫能力有關。在窗口期，可以通過病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細胞水平來確定HIV感染。在HIV感染的整個過程中，CD4淋巴細胞水平逐漸下降，當其水平降低至200個細胞/毫升血液時，就會導致嚴重的免疫缺陷，HIV感染者將發展為AIDS[4]。在大部分HIV感染者體內最先出現的抗體類型是IgM。IgM一般在HIV感染后第3w出現，并在第4~5w達到峰值。然而由于個體差異及方法學靈敏度等原因，IgM并不能在每個HIV感染者血液中檢出[5]。HIV特異性IgG通常在感染后3~4w出現，隨后IgG滴度迅速上升，直至10~12w左右開始下降。IgG滴度的降低是由IgG3亞型的降低導致的，隨后IgG滴度再次迅速增加[6]。盡管有個體可能6個月后才出現HIV抗體，但大多數HIV感染者血液中2~3個月都能檢測到HIV抗體[7]。HIV抗體的出現抑制了HIV病毒的復制，并形成p24特異性抗體/p24復合體，降低了血液中的RNA及p24水平。最終，HIV感染者發展為AIDS，免疫系統崩潰，病毒再次大量復制，血液中的RNA、p24水平再次升高。因此，通過檢測病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細胞以及HIV抗體在血液中的含量，可以診斷HIV感染及監控病情的發展。

2HIV實驗室檢測方法

2.1 HIV抗體檢測目前，檢測HIV抗體的方法多達100余種，總體來說可以分為篩查試驗和確認實驗。只有擁有較高靈敏度，即較低假陰性率的檢測方法才能用于篩查試驗。相反，確認實驗對檢測方法的要求是高特異性，即檢測結果具有較低的假陽性率。一般情況下，篩查實驗篩查出陽性的標本必須要經過確認實驗再次檢測，以達到確認檢測結果的目的

2.1.1 HIV抗體篩查試驗目前，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是最常用的篩查試驗。1985年，美國FDA批準使用第一代ELISA檢測試劑篩查HIV，可以在感染后40d左右篩查出HIV特異性抗體，第一代試劑主要以病毒的裂解產物或部分純化的病毒抗原包被反應板，采用間接法篩查HIV。由于常混雜有細胞培養中的蛋白成分或其他雜蛋白而出現較多的假陽性反應。1990年，第二代ELISA試劑將重組或合成的多肽抗原（包括M，N，O）包被在反應板中，實現了HIV-I和HIV-II同時檢測，并將檢出時間縮短為33~35d。由基因重組獲得的抗原具有良好的同源性，產品的靈敏度與特異度較第一代試劑有了很大的提高[8]。1992年，第三代ELISA試劑檢測方法與前兩代不同，采用雙抗原夾心法檢測抗體。由于其可以檢測所有抗體亞型(包括IgG，IgM，IgA)，因此具有更高的靈敏度與特異性。第三代ELISA試劑將HIV抗體檢測的“窗口期”縮短為22天左右。第四代ELISA試劑在第三代的基礎上進一步增加了p24抗原的檢測，可同時檢測HIV抗體及p24抗原，進一步縮短了“窗口期”，減少了急性感染窗口期漏檢。但由于“第二窗口期”的存在，也使得第四代試劑檢測的敏感性受到影響[9]。目前，在我國第三代試劑應用最為廣泛，第四代試劑還沒有普及。第三代和第四代試劑的特異性大約在99.5%~99.9%，這就意味著可能會有一定假陽性的出現。假陽性結果一般是由于非特異性抗體結合HIV抗原導致的[10]。某些病毒感染的患者在進行HIV篩查時可能出現假陽性的結果。此外，患有自身免疫性疾病、惡性淋巴瘤的患者也可能會出現假陽性的結果[11]。鑒于篩查實驗可能會出現假陽性的結果，只有進行確認試驗后才能得出HIV陽性的結論。

2.1.2 HIV抗體確認試驗目前，HIV確認實驗主要有免疫印跡實驗（western blot，WB）和線性免疫分析法（line immune assays，LIA）兩種，其中前者最為常用。WB通過SDS-PAGE電泳將HIV全病毒抗原按照分子量的大小分離開來，然后再從凝膠轉移到固相支持物硝酸纖維素膜上。如HIV-1，分離開來的病毒抗原可分為三帶：①env帶，指gp160、gp120、gp41；②gag帶，指p55、p24/25、p17；③pol帶，指p68、p52、p40、p34。經稀釋過的待檢血清樣品直接加到硝酸纖維素膜上，若血清中含有HIV抗體，則會與膜上的抗原帶結合。然后加入酶標的第二抗體和底物，根據條帶的顯色情況來判定結果。根據國際公認的美國CDC判斷標準，出現以下兩種情況就可判斷為陽性：①至少有二條env帶（gp160/gp120和gp41）；②至少有一條env帶和p24帶同時出現。目前，HIV商品化試劑盒同時含有HIV-1與HIV-2抗原，可實現兩種亞型的同時檢測。與ELISA方法相比較，WB具有更高的敏感度和特異性，然而由于病毒在濃縮和純化后仍可能存在培養用的宿主細胞，出現非特異性反應，大多數出現在中分子量區域，產生不確定結果。線性免疫分析法原理與蛋白質印跡法相似，但與蛋白質印跡法相比較，線性免疫分析法價格較為昂貴，應用受到限制。

2.2 HIV快速檢測試驗HIV快速檢測試驗主要包括免疫斑點試驗、免疫層析試驗以及凝集試驗等。HIV快速檢測試驗可檢測血漿、末梢血、尿液、唾液等標本，并在30min鐘內完成檢測，因此在一些緊急篩查時，如急診手術、穿刺等，顯得尤為重要。然而，有調查表明HIV快速檢測試驗的敏感度僅為90.2%，其敏感度與ELISA和WB相比要低得多，因此將會導致漏檢情況的出現[12]。此外，HIV快速檢測試驗的特異性也較低。據Gray的一份研究表明，94.1%快速檢驗弱陽性的標本經確認實驗復檢后得出陰性或不確定的結論[13]。鑒于快速檢驗敏感度和特異性較低，專家建議快速檢驗應與ELISA或WB聯合應用[14]。HIV快速檢測試驗操作簡便，成本較低，要求的標本量較小，適合于基層醫院HIV的快速篩查，尤其對發展中國家或偏遠地區具有重要的意義[15]。

2.3 HIV核酸檢測隨著技術的發展，核酸檢測的靈敏度已經得到質的飛躍，甚至達到超靈敏，使一些極為微量的RNA樣品分析成為可能。目前，HIV核酸檢測方法主要包括聚合酶鏈反應，轉錄介導擴增，支鏈DNA，連接酶鏈反應以及實時熒光定量PCR技術等。這些方法在許惠敏等的論述中已有詳細描述，在此不再贅述[16]。HIV病毒RNA檢測被廣泛應用于檢測病毒抗轉錄治療后的監測，病毒載量與HIV病毒RNA成平行關系。隨著第三代及第四代ELISA試劑的應用，HIV血液傳播被有效的控制，然而如果進一步降低“窗口期”的傳播，就需要核酸檢測進行支持。HIV病毒的易變性也嚴重影響著核酸檢測的靈敏度。當存在HIV變種的情況時，引物和探針都具有特異性不能發揮擴增的作用，因此HIV核酸檢測應用受到限制。

2.4流式細胞技術流式細胞儀是一種能夠探測和計數以單細胞液體流形式穿過激光束的細胞檢測裝置，是分離和鑒定細胞群及亞群的一種強有力的應用工具。淋巴細胞是正常機體免疫系統功能最重要的一大細胞群，在免疫應答過程中，淋巴細胞發育成功能不同的亞群，各亞群的數量和功能產生異常時，就會導致機體免疫紊亂并產生病理變化。HIV病毒感染整個過程中，總CD4淋巴細胞水平隨感染的發展而逐漸降低，當其在血液中下降到200個/ml時，就會導致嚴重的免疫功能障礙，即發展為AIDS。通過流式細胞儀對血液中的T細胞亞群分類并計數，可以發現HIV感染者血液中的T淋巴細胞總數及百分數、CD4淋巴細胞及百分數、CD4淋巴細胞與CD8淋巴細胞比值均降低，從而提示HIV感染的可能性。

在過去的20多年里，隨著生物技術的不斷進步，HIV檢測方法也在不斷的提高，HIV感染的窗口期也隨之縮短。隨著生物技術的進一步發展以及HIV感染機制的明確，新的檢測技術將會出現，為HIV感染的篩查、診斷、監測及控制提供強有力的支持。

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編輯/王敏