泮托拉唑對耐亞胺培南的鮑曼不動桿菌主動外排泵的抑制作用

摘要：目的 了解外排泵系統在鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗生素機制中所起的作用，觀察泮托拉唑逆轉鮑曼不動桿菌亞胺培南耐藥的作用，為多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的治療提供實驗室數據。方法 收集亞胺培南中介或耐藥的鮑曼不動桿菌36株，采用瓊脂平板二倍稀釋法重新測定亞胺培南對實驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)，同批測定加入外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)、 泮托拉唑（PTZ）后抗菌藥物的MIC值。結果36株實驗株中加入羰基氰氯苯腙(CCCP)后亞胺培南MIC值明顯降低的有13株（ＭＩＣ降低4倍或以上），在這13株鮑曼不動桿菌（外排泵陽性組）中加入泮托拉唑后亞胺培南MIC值也有明顯下降(P<0.05)。結論 鮑曼不動桿菌桿對碳青霉烯類藥物的主動外排在其耐藥機制中起著非常重要的作用，外排泵陽性菌株中加入泮托拉唑后亞胺培南MIC值降低，增加了鮑曼不動桿菌對亞胺培南的敏感性，具有一定的應用前景。

關鍵詞：鮑曼不動桿菌；外排泵抑制劑；亞胺培南

中圖分類號：R378文獻標識碼：A

Inhibition Effect of Pantoprazole on Active Efflux Pump in Baumannii Acinetobacter in Imipenem Resistant Strains

ZHOU Yi-quan1，ZHOU Jian-wei1，XIA Zhong-di2

(1.Department of Infectious Disease，Xiangdong Hospital Affiliated to Hunan Normal University，Zhuzhou 412200，Hunan，China;2.Department of Microbiology，Xiangya Medical College of Central South University，Changsha 410078，Hunan，China)

Abstract：ObjectiveTo understand the role and distribution of multidrug efflux pumps in clinical isolates of carbapenems resistant Acinetobacter baumannii， investigate the reversal resistant in Acinetobacter baumannii by pantoprazole， and thus to provide information for selection of antibiotics for the treatment of mutlidrug-resistant infections. MethodsA total of 36 non-duplicate clinical isolates were recovered and antimicrobial susceptibility was conducted by agar dilution methods with or without the inclusion of pantoprazole or carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) . ResultsThe results showedthat 13isolatesaftertreatmentofimipenemwithCCCP were positive of efflux mechanism(their MIC reduced by 4 times or more). The same result was deteced when pantoprazole and imipenem were added to the dilution(P < 0.05). ConclusionEfflux plays a important role in carbapenems resistance in the clinical isolates of A.baumannii. Pantoprazole could enhance antibiotic acticities of imipenem to Acinetobacter baumannii including multidrug efflux pumps，and has certain application prospect.

Key words：Bauman Acinetobacter;Efflux pump inhibitors; Imipenem鮑曼不動桿菌耐藥現象日益嚴重，呈現多重耐藥、泛耐藥趨勢。多重耐藥（multiple drug resistance， MDR）是指細菌同時對三種以上不同類型抗菌藥物產生耐藥[1]。主動外排系統是引起鮑曼不動桿菌多重耐藥的重要原因，在鮑曼不動桿菌中發現的主動外排系統adeABC和 adeDE系統均屬于耐藥結節化細胞分化族(RND)。RND家族介導的主動外排是以質子跨膜濃度梯度作為外排動力的，即排出一個藥物分子的同時一個H+進入胞內 。針對細菌利用主動外排系統產生多重耐藥的特點，對主動外排抑制劑的研發為多重耐藥菌感染的治療提供了一種新思路[2]。研究發現，質子泵抑制劑碳酰氰基-對-氯苯腙(CCCP)具有抑制鮑曼不動桿菌主動外排的作用，可提高其對抗生素的敏感性。但由于CCCP毒性很大，不能用于臨床。臨床廣泛應用的質子泵抑制劑主要為奧美拉唑、泮托拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑，均屬于H+/K+-ATP酶抑制劑，阻斷胃壁細胞內質子泵驅動細胞內H+與小管內K+交換，從而阻斷了胃酸分泌，廣泛應用于胃十二指腸潰瘍等胃酸相關性疾病，本文旨在探討質子泵抑制劑對提高多重耐藥鮑曼不動桿菌對抗生素敏感性方面的作用，該類藥物如果能像CCCP一樣抑制細菌主動外排，就能有效提高細菌內藥物濃度，增強抗菌藥物殺菌作用，應用前景值得期待。

1資料與方法

1.1菌株來源收集湖南師范大學附屬湘東醫院、中南大學湘雅醫院、長沙旺旺醫院經自動細菌鑒定藥敏分析儀分離、鑒定為亞胺培南中介或耐藥的鮑曼不動桿菌36株，再次使用本院梅里埃全自動微生物檢測儀鑒定確為鮑曼不動桿菌。

1.2主要試劑與儀器瓊脂糖為Amersco公司產品；羰基氰氯苯腙(CCCP)購自Sigma公司；泮托拉唑購自大連美侖公司；亞胺培南購自武漢豐竹化學科技有限公司；所用主要儀器：上海智城空氣搖床；SANYO公司超低溫冰箱；法國梅里埃公司Vitek-32全自動微生物分析儀；上海躍進農場醫療器械恒溫培養箱。

1.3方法

1.3.1菌株準備將純菌轉種于LB 培養基傳代1～2 次后，接種于LB液體培養基搖菌12h后加10％DMSO保存于-70℃冰箱中待用，分別編號為Ab1～Ab36。藥敏實驗質控株鮑曼不動桿菌ATCC19606為湘雅醫院檢驗科贈送。

1.3.2抗菌藥物的配制分別稱取81.92mg亞胺培南有效成分，加入 4ml 溶劑溶解，制備成濃度為 20480μg/ml的原藥備用。

1.3.3平板制備以美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS) 2009年版標準為依據[3]。具體操作如下:采用瓊脂平板稀釋法，根據 NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標準，藥物濃度范圍應包含耐藥、中介和敏感分界點值。將倍比稀釋后不同濃度的亞胺培南溶液分別加入滅菌的瓊脂平板中，第1~第12號平板中加500μl藥液，制作成20ml瓊脂平板，第13號平板不加藥作為生長對照，分別編號為A1～A13，此時，第1至第12號平板中藥物亞胺培南濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml；同時制備與A1～A13含相同亞胺培南濃度的B1～B13、 C1～C13平板，B1～B13平板含CCCP(終濃度20μg/mL，約100μmol/L)， C1～C13平板含泮托拉唑(終濃度80μg/mL，約180μmol/L)，每個編號的平板各制備37個。

1.3.4藥敏試驗采用瓊脂稀釋法。將鮑曼不動桿菌標準株ATCC19606和鮑曼不動桿菌Ab1～36及標準株ATCC19606采用細菌多點接種儀器分別接種于A1～A13、B1～B13、 C1～C13平板中，放入37℃恒溫箱中過夜培養，觀察并記錄ABC三組平板中各個菌株的最小抑菌濃度（即MIC值）。

1.4統計學分析采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，兩樣本間的均數比較采用t檢驗， P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1外排泵抑制劑對鮑曼不動桿菌的抑制作用鮑曼不動桿菌ATCC19606﹑36株臨床分離的鮑曼不動桿菌在對照瓊脂平板（不含亞胺培南的A13、B13、C13平板）上均生長良好，說明實驗中選擇外排泵抑制劑的濃度對鮑曼不動桿菌生長無明顯直接抑制作用。

2.2外排泵抑制劑聯合亞胺培南對鮑曼不動桿菌MIC的影響36株鮑曼不動桿菌對亞胺培南的MIC幾何平均值為20.82μg/ml，加入外排泵抑制劑CCCP后有13株鮑曼不動桿菌MIC值下降4倍以上，被視為外排泵陽性株[4]，其余23株MIC值無明顯變化或僅輕度下降，被視為外排泵陰性株，兩組鮑曼不動桿菌的MIC值幾何均數見表1。經t檢驗可得出，外排泵陽性組中，加入CCCP、泮托拉唑后鮑曼不動桿菌的亞胺培南MIC幾何均值均顯著下降(P<0.01)，且以加入CCCP后下降更為顯著(P<0.05)，而外排泵陰性組中，加入CCCP、泮托拉唑后鮑曼不動桿菌的亞胺培南MIC幾何均值差異無統計學意義(P>0.05)。

3討論

細菌多重藥物主動外排轉運系統尤其是(RND)外排泵的作用底物廣泛，不僅包括抗菌藥物，對消毒劑、洗滌劑和染料也有一定的外排作用，甚至包括外排泵抑制劑本身[2]。自20世紀80年代以來，越來越多的主動外排系統被發現，并且在臨床常見病原菌的耐藥機制中發揮重要作用。在不動桿菌屬中，現在已經發現和報道的主動外排泵系統有AdeABC、Ade DE、AdeXYZ、AdeIJK，它們都屬于耐藥節結化分化家族(RND)，其中AdeABC是最先在鮑曼不動桿菌中被發現的主動外排泵系統[5]，已經被證實與鮑曼不動桿菌對多種抗菌藥物耐藥有關。在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制中，目前主動外排泵所起的作用還存在著研究結果上的分歧。Héritier[6]等研究者通過測定鮑曼不動桿菌菌株CIP70.10和它的點突變菌株BM4547（該突變菌株過度表達AdeABC外排泵）對亞胺培南和美洛培南的MIC值，發現過表達AdeABC外排泵的菌株BM4547的MIC比菌株CIP70.10的MIC增高2倍，推測AdeABC外排泵在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制中可能是起作用的。Hu[7]等研究者在臨床分離的耐藥菌株培養基中加入外排泵抑制劑CCCP后，發現細菌對亞胺培南的MIC降低了4~8倍。細菌外排泵對藥物的外排作用是主動耗能過程，其能量源于質子的濃度梯度。CCCP是抑制質子轉運的解耦聯劑，通過破壞質子濃度梯度，抑制主動外排系統的外排作用，使藥物在細菌體內的蓄積量增加， 從而提高細菌對藥物的敏感性。CCCP雖然能夠顯著抑制鮑曼不動桿菌主動外排泵，提高鮑曼不動桿菌對多種抗菌藥物的敏感程度，但CCCP對人體存在毒性，故僅限于科研實驗使用，不可能應用于臨床。利血平和維拉帕米是ATP水解能驅動型外排泵抑制劑第一代產品，此類外排泵抑制劑的特點是與膜糖蛋白結合的特異性和親和性均不高，在臨床上有各自的適應癥，需要的抑制劑量較高，不良反應明顯，因此限制了其在臨床上的應用。泮托拉唑是質子泵抑制劑(proton pump inhibitors， PPIs)的一種，臨床上用于消化性潰瘍的治療。國內學者報道[8]，鮑曼不動桿菌在環丙沙星加入奧美拉唑(20mg/L)后篩選出的外排陽性菌僅7株(9.2%)，其篩選率低于CCCP和利血平，國外實驗表明奧美拉唑(100μg/mL)對NorA外排泵高表達金黃色葡萄球菌有抑制作用，可使諾氟沙星﹑環丙沙星和左氧氟沙星MIC降低4倍或8倍[9]故質子泵抑制劑作為外排泵抑制劑的應用前景值得期待。

目前國內外對鮑曼不動桿菌外排底物的研究多選擇喹諾酮類或氨基糖苷類藥物進行研究[10]，在本實驗中我們選擇經臨床實驗室證明對亞胺培南中介或耐藥的36株鮑曼不動桿菌作為實驗對象，以屬于碳青霉烯類的亞胺培南作為外排底物，觀察了CCCP﹑泮托拉唑對其MIC值的影響，觀察聯合泵抑制劑前后鮑曼不動桿菌體外對抗菌藥物敏感性的變化，研究提示主動外排泵在臨床分離的鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制中起作用。本研究中，CCCP 能抑制部分鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的排出，使其敏感性增強，耐藥性降低，說明主動外排泵對鮑曼不動桿菌的耐藥表型有影響。以泮托拉唑作為泵抑制劑時，能顯著降低其抑制鮑曼不動桿菌對亞胺培南的MIC值(P<0.01)，但抑制鮑曼不動桿菌主動外排的作用弱于CCCP(P<0.05)。

鮑曼不動桿菌的多重耐藥和泛耐藥給臨床治療提出了難題，泵抑制劑能抑制鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的泵出，降低耐藥性。因此，主動外排泵和抗菌藥物的聯合應用，將在臨床上有廣闊的前景。但CCCP對人體有毒性作用，而別的外排泵抑制劑比如利血平也有較多副作用，從藥物研發的角度開發更有效且無毒的外排泵抑制劑，使其和碳青霉烯類抗生素等藥物聯合使用將有可能逆轉某些耐藥菌的耐藥現象，以提高臨床治療效果。泮托拉唑作為質子泵抑制劑在臨床應用已經數10年，其安全性已經得到臨床檢驗。本實驗顯示：泮托拉唑抑制鮑曼不動桿菌主動外排的作用弱于CCCP，但還是能顯著降低鮑曼不動桿菌對亞胺培南的MIC值，具有一定實用價值，但是實驗使用濃度高于臨床常用治療劑量時的血藥濃度，其安全性有待進一步檢驗。外排泵抑制劑與抗菌藥物聯合使用為逆轉細菌的耐藥性提供了一種新的思路，目前對于主動外排抑制劑的研究還處于起步階段，由于泵抑制劑的有效抑制濃度遠大于作為臨床藥物應用的濃度，對人體的毒副作用較大，因此局限于體外研究試驗，開發效果更好而不良反應較低的外排泵抑制劑是我們進一步探討和研究的目標。

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