針對斑點免疫印跡法中藥藥性物質基礎的研究分析

【摘要】中藥藥性是中藥研究發展過程中，一個非常重要的部分，目前，我國對于中藥的研究非常重視，文章主要針對的是斑點免疫印跡法對中藥藥性的研究和分析，我們以幾味典型的中藥提取物為研究的對象，將其作為對照抗原，然后，在制造出于其相對應的寒性，熱性的對照抗體，并將之與其它中藥水提物作為斑點免疫印跡，之后再根據對照抗體對不同藥性中藥提取物所產生的反應，比較其藥性之間的相似程度，并做出分析和總結，進而提出研究設想。

【關鍵詞】斑點免疫印跡法；中藥藥性物理基礎；研究

【中圖分類號】R285.1 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）08-0124-02

一引言

中藥在我國醫藥領域的地位非常重要，它在我國的歷史悠久，對于人們的身體健康以及醫學領域的影響十分深遠。對于中藥藥性的研究，我們一直沒有停止。中藥最為一種客觀存在物質，其具有本質屬性與非本質屬性兩個方面，那么其本質屬性主要以從其藥性的方面表現出來的，現階段，我國對于中藥藥性的研究主要是在其作用于機體后所顯出的反應方面，中藥作用于機體后，機體會呈現出一種反應，這種反應具有一定的物質基礎，而我們所研究的正是在這一基礎之上的規律性，簡單的說，中藥的品種多樣，但是這其中必然會存在一些藥性相同或相近的藥物，這些藥物之間是否也存在相同或相近的物質構成，這個問題，成為了目前，重要研究領域的一個重點、難點。

二免疫印跡法

1.免疫印跡法是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。

2.與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

三斑點免疫印跡法中藥藥性物質基礎的研究分析

1.藥性相同的中藥之間是否存在相似或者相近的物質構成

這個問題，學者們給出的答案有兩種，一個是肯定回答，就是相同的藥性藥物之間有相似的的物質結構，如果是運用目前最為科學的制備圖譜技術來描繪的話，就能夠繪制做出中藥藥性的規律，而另一答案則是否定的，就是雖然相同的藥性中藥之間雖然存在相似的物質結構，但是這種結構卻沒有規律可言，若是基于這種結論對中藥藥性進行研究，我們也就只能夠從單獨的藥物出發，具體研究每一味藥作用與機體后，所出現的，寒、熱、涼等反應，不然，我們在中藥藥性物質規律的研究方面，就完全屬于空談和假想。那么，怎樣才能夠證明其規律性的存在呢，首先我們需要一個與中藥藥性完全不同的標準，中藥藥性是一個客觀的存在，因此，其這一表征中藥藥性物質基礎的綜合信號或指標應當從反映中藥物質組成本質屬性的指標中選擇，免疫原性可以整體表征中藥物質基礎的本質屬性，免疫原性作為物質基礎規律性驗證的綜合指標是中藥藥性研究的必然選擇。

2.研究假說

分別選用10味典型寒、熱性中藥的水提物作為對照抗原，免疫動物后制備相應的寒、熱性對照抗原抗體，以之與其他不同藥性中藥水提物作斑點免疫印跡，依據對照抗原抗體對不同藥性中藥水提物抗原的免疫識別作用，根據雜交信號的有、無和強、弱，平行比較不同藥性中藥之間物質基礎的相似度。相同藥性的中藥之間存在相近或相似的物質基礎，可以應用相應分析軟件對雜交信號作軌跡定量掃描分析，根據同一中藥與寒、熱性對照抗原抗體的雜交信號的大小，作聚類分析，作出中藥藥性寒、熱程度的距離圖譜。與對照抗原距離越小，表明該味中藥的物質構成與對照抗原中藥之間越接近，否則，二者的差別就越大。

3.技術路線

應用斑點免疫印跡法進行中藥藥性物質基礎研究的詳細技術路線如下。

3.1經典寒性中藥的選擇

用于制作寒性對照抗原的寒性藥物可以選擇為：黃連、大黃、知母、梔子、淡竹葉、黃柏、秦皮、金銀花、大青葉、蒲公英。該十味要的藥水提取物進行混合，然后在進行對照抗原的對比，這樣就會產生交叉信號，如果出現的中藥信號與整個信號相近程度高，雜交信號越強，藥性越趨向于寒性，反之，則遠離寒性。如果沒有以上雜交信號的規律性出現，則說明寒性中藥之間不存在抗原性相近的物質基礎。

3.2經典熱性中藥的選擇

在制作熱性對照原時候，我們首先要選擇相對應的中藥，那么我們常用的熱性藥物，基本為附子、肉桂、干姜、吳茱萸、高良姜、胡椒、仙茅、淫羊藿、杜仲、蓽苃。這十味中藥的提取物進行混合，經過作用后進行熱性中藥的對照抗原制作。那么如果熱性中藥之間真的是存在一種相似的物質基礎，那么從理論上來講，與熱性對照抗原抗體作免疫印跡，將出現雜交信號，熱性中藥的抗原性與對照抗原越接近，雜交信號越強，其藥性越趨向于熱性，反之，則越遠離熱性。如果沒有以上雜交信號的規律性出現，說明熱性中藥之間不存在抗原性相近的物質基礎。

3.3寒、熱性對照抗原多克隆抗體的制備

取20味用作對照抗原的寒、熱性中藥水提物的凍干粉等量混合后，用生理鹽水溶解，配成2g/L的溶液。初次免疫用等量完全弗氏佐劑充分混勻乳化后，于新西蘭大白兔背部皮下多點注射，2mL/只，以后，每10天加強免疫1次，加強免疫以不完全弗氏佐劑取代完全弗氏佐劑，劑量與初次免疫相同。4次加強免疫后從耳緣靜脈采血，采用間接競爭酶聯免疫法測定抗血清效價，待效價達到要求后，用耳靜脈放血與心臟放血相結合獲得抗血清，-20e保存備用。

3.4斑點免疫印跡檢測

本文所提出的斑點免疫印跡法，是一種建立在國際經典Western-blot技術上的基于藥物免疫原性的免疫雜交方法[1]。基于寒、熱性對照抗原抗體對其他中藥所含相同或相似組分的免疫識別作用，以免抗對照抗原多抗為一抗，與不同藥性中藥水提液在硝酸纖維素膜上作免疫雜交，經HRP標記的二抗催化底物ECL顯色，應用相關軟件對雜交斑點作定量分析。

3.5聚類分析

同一味中藥分別用2種寒、熱性對照抗原抗體作斑點免疫印跡，得到兩組不同變量數據，每組數據的變量包括：斑點軌跡峰值、斑點雜交信號量、與對照抗原的相似度。以此作為聚類指標，根據大量中藥的斑點免疫印跡信息做出中藥藥性寒、熱程度的距離圖譜。

4.研究設想

通過整篇文章的研究和闡述，我們能夠得出，在對照抗原抗體對中藥相同或者相似成分的反應的基礎上，我們使用了免疫試劑盒制備技術，研制用于定性與定量檢測以植物藥為主的中藥藥性檢測免疫試劑盒的研制。這種藥性檢測免疫試劑盒不但能夠定性判別中藥藥性，而且能夠定量分析中藥藥性的寒熱程度。

四、結束語：

我國對于中藥的發展，是在其藥性研究基礎之上的，相關學者對于中藥的藥性，以及相同或相似藥性的中藥之間的物質基礎進行了多年的分析和研究，并充分利用斑點免疫印跡法，取得了一定的成果，這對于我國中藥的發展和進步，有著非常積極地作用。

參考文獻

[1]許利平；孫建寧；張冰 中藥寒熱藥性現代研究手段中國中醫基礎醫學雜志2010.1.28

[2]王薇； 李峰 中藥藥性物質基礎研究現狀分析 西北藥學雜志 2011 08 01

[3]周正禮； 李峰； 王文炳； 李靜文中藥藥性與物質基礎關系的研究進展 遼寧中醫雜志 2010 04 18