SARS—CoVN蛋白通過AHSG介導影響機體糖脂代謝的實驗研究

【摘要】目的 研究分析SARS-CoVN蛋白通過AHSG介導對機體糖脂代謝的影響。方法 首先進行SARS-CoVN蛋白的原核誘導表達與純化，再進行人血清中AHSG蛋白的純化。結果 SARS-CoV N蛋白和AHSG直接進行相互作用，由AHSG介導控制胰島素信號通路，從而影響到機體的糖脂代謝。結論 SARS-CoV N蛋白通過AHSG介導，能夠降低機體對胰島素的敏感性，進一步誘發機體糖脂代謝出現異常現象。

【關鍵詞】SARS-CoVN蛋白；AHSG；糖脂代謝

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）08-0145-01

SARS-CoVN蛋白和AHSG直接發生作用，并由AHSG介導控制胰島素信號通路，對機體糖脂代謝產生相應的影響[1]。本文選取AHSG基因已經敲除的C57野生型小鼠，重點分析SARS-CoVN蛋白對于小鼠糖脂代謝的影響。現將結果報告如下：

1資料與方法

1.1一般資料

（1）從北京天根科技有限公司購買HL7702細胞，從和我校有合作關系的浙江省寧波醫藥高等專科學校加強合作，并在該校相關人員的幫助下找取Balb/c雌性小鼠，C57雌性野生型小鼠，C57雌性AHSG基因敲除小鼠，以及人血清、人胰島素注射液、Pet22b-SARSN菌株（校實驗室保存）。

（2）在浙江省寧波醫藥高等專科學校相關人士的幫助下，獲取鼠抗人AHSG抗體，羊抗鼠二抗及實驗所用的培養基、試劑盒及試劑等用品。

1.2方法

（1）SARS-CoVN蛋白的原核誘導表達與純化。具體步驟：①IPTG誘導，主要用含SARS-CoVN蛋白的重組質粒轉變為大腸桿菌，再用2ml新鮮的菌液轉接至5個LB液體培養基（200mL）中，然后字37℃搖床中進行培養，直至OD數值達到0.65，再加入200ul 1mol/L的IPTG，將其置于30℃的條件下誘導約6h，按照4000rpm/min的速度離心15min后收集菌體。最后用60mL溶液重懸液體，按照上述速度離心15min后重懸2遍液體。②超聲破碎，把菌體中含蛋白酶抑制劑的溶液重懸以后，放置冰上超聲破碎菌體，每次約2min，每隔5min進行冷卻，進行5次超聲直至菌體溶液變為透明形狀。③離子交換及分子篩。用AKTA層析系統，并用強陽離子交換方法進行純化，用溶液A洗層析柱，再用超聲破碎以后的上清液用溶液A進行稀釋，按照1ml/min的速度上樣，用1mol/L的NaCL溶液進行洗脫，再把洗脫液分布收集實施SDS-PAGE電泳。最后，把離子交換以后的洗脫液濃縮成10mL，用1*PBS溶液洗分子篩柱，待其上樣以后再次實施溶液洗柱并收集峰洗脫液，電泳。用考馬斯亮蘭法測定洗脫液中的蛋白，當檢測出蛋白濃度以后，將他們分裝在零下80℃冰箱中保存。

（2）AHSG蛋白的純化。具體步驟：①沉淀硫酸銨，先配制飽和濃度的硫酸銨溶液，選取50mL將其凍存在人血清中并在37℃的水浴進行融化，溶于同體積的生理鹽水進行稀釋，待其均勻混合后，加入100mL左右飽和的硫酸銨溶液，攪拌均勻后，將混合后的溶液放置在4℃條件下實施磁攪拌約10min，并在4℃條件下離心30分鐘，棄上清。②沉淀PEG，先配制濃度為50%的PEG8000溶液，當沉淀出50mLPEG重懸Buffer以后加入同體積濃度為50%的溶液，均勻攪拌，將混合溶液放置冰上攪拌約2h后，置于1200*g，4℃條件下進行離心約15分鐘，選取上清液留作備用。③DEAE離子交換，用去離子水洗DEAE柱，為下面離子交換做好準備， 再用Buffer A平衡DEAE柱，把PEG沉淀以后的上清加入該溶液中，用Buffer A進行平衡，用Buffer B洗脫。④DEAE洗脫液的脫鹽，再進行Protamine親和層析。

1.3統計學處理

用SPSS14.0統計包統計分析本研究所得數據，用X2檢驗計數資料，用t檢驗計量資料，以P<0.05為結果有統計學意義。

2結果

通過研究分析SARS-CoV N蛋白對小鼠糖脂代謝，及利用、清除葡萄糖的能力，對于胰島素敏感性產生的影響可知：SARS-CoV N蛋白和AHSG直接進行相互作用，由AHSG介導控制胰島素信號通路，從而影響到機體的糖脂代謝

3討論

3.1胰島素作用

胰島素主要靶組織是肌肉、肝臟和脂肪組織，對糖類、脂肪、蛋白質的代謝起著調節作用，能使葡萄糖的利用加速而抑制葡萄糖的生成，起到降低血糖的作用。胰島素可以增加細胞膜對葡萄糖的通透性，使葡萄糖從細胞外轉運到細胞內；又能增強肝內的葡萄糖激酶和肝外的己糖激酶活性，加快葡萄糖的酵解和氧化[2]。

3.2研究結果分析

AHSG和細胞表層胰島素受體相互結合以后，可以有效控制胰島素信號通路，影響機體的糖脂代謝，同時它還可以控制胰島素刺激的3T3-L1脂肪細胞IRS與Akt蛋白磷酸化。AHSG能夠有效抑制胰島素信號通路活化，它在脂肪細胞胰島素信號通路中發揮著關鍵性作用。本試驗結果表明：胰島素處理可以讓SREBR-1，FAS表達量增加，同時AHSG可以有效控制胰島素處理導致的胰島素信號通路下游基因表達量增加。在教學過程中，通過向學生講述RS-CoV N蛋白通過AHSG介導對機體糖脂代謝的影響，讓學生了解到AHSG在胰島素信號通路中起到的生物作用，進而為學生走向工作崗位后治療肥胖、糖尿病及代謝綜合征提供新思路。

為了深入研究SARS-CoV N蛋白對于糖脂代謝、胰島素信號通路產生的影響，本實驗通過對C57野生型小鼠、C57AHSG基因敲除小鼠實施胰島素耐量、葡萄糖耐量試驗，當對小鼠注射SARS-CoV N蛋白以后，C57WT小鼠對于葡萄糖的清除能力明顯降低，與此同時，C57KO小鼠對于葡萄糖的清除能力提高。總之，SARS-CoV N蛋白通過AHSG介導，能夠降低機體對胰島素的敏感性，進一步誘發機體糖脂代謝出現異常現象。

參考文獻

[1]張春梅.SARS-CoV N蛋白通過AHSG介導對小鼠糖脂代謝的影響[D].安徽大學，2014.

[2] 王艷；N蛋白相互作用蛋白基因多態性與SRAS冠狀病毒易感性的關系[D]；中國人民解放軍軍事醫學科學院，2008