急性B淋巴細胞白血病病兒miR－21表達及意義

劉秀琴，于樹紅，孫立榮

（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，山東 青島 266003）

急性B淋巴細胞白血病（B－ALL）是兒童常見急性白血病，病死率高，嚴重威脅病兒生命，迄今為止，其發(fā)病機制仍不明確？microRNA（miRNA）為一類由20～25個核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平表達的調(diào)控［1］，其表達失調(diào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的調(diào)控作用［2－5］。microRNA－21（miR－21）為重要的致癌基因，已有研究顯示，miR－21在T淋巴細胞白血病和 NK 細胞 白 血 病 中 高 表 達［6－7］，miR－21高 表 達與前B細胞淋巴瘤的發(fā)病密切相關［8］。本研究用實時熒光定量PCR法，檢測B－ALL病兒miR－21表達水平及其化療前后變化，探討其在兒童B－ALL發(fā)生、預后中的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2006年10月—2010年10月，取青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科及青島市市立醫(yī)院小兒科初診BALL病兒36例，男15例，女21例；年齡1～14歲，平均7.5歲；其中高危型13例，標危型23例。按細胞形態(tài)學、免疫表型、遺傳學、分子生物學（MICM）診斷標準確診，經(jīng)流式細胞術檢測均為B－ALL。病兒均給予長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶和強的松（VDLP）方案化療，分別于化療前及化療后第2周末采集骨髓？臨床2個療程內(nèi)完全緩解（CR）者為體內(nèi)敏感；臨床2個療程不緩解者，骨髓白血病細胞下降指數(shù)（MBDI）≥60%為體內(nèi)敏感，＜60%為體內(nèi)耐藥。MBDI＝（化療前骨髓白血病細胞（%）－化療后骨髓白血病細胞（%））／化療前骨髓白血病細胞（%）×100%？以骨髓常規(guī)正常的非造血系統(tǒng)疾病病兒12例為對照組，近期未應用過糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑，其中男8例，女4例；年齡1～12歲，平均6.5歲？

1.2 miR－21表達檢測

1.2.1 骨髓單個核細胞（BMMCs）的分離 取骨髓5mL，EDTA抗凝，用生理鹽水稀釋3～4倍，然后將其緩慢加至Ficoll淋巴細胞分離液4mL中（相對密度1.077），以2 000r／min離心16min？取界面層得BMMCs，用生理鹽水洗滌3次，以2×108／L的密度接種于含150g／L新生牛血清（Hyclone公司）的RPMI－1640培養(yǎng)液（美國GibcoBRL公司，內(nèi)含有100kU／L青霉素和100kU／L鏈霉素）中，置37℃、體積分數(shù)0.05CO2和全濕條件下培養(yǎng)？

1.2.2 總RNA的提取及實時熒光定量PCR檢測按Trizol（Invitrogen公司）試劑說明書提取細胞總RNA，為增加miRNA獲得率，將異丙醇沉淀步驟改為－20℃沉淀2h以上。檢測RNA溶液吸光度（A）值，A260／A280值＞1.8方可用于檢測。加poly（A）尾后，應用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司）進行逆轉(zhuǎn)錄反應，以Oligo（dT）為引物，反應條件如下：16℃30min，37 ℃ 30min，70 ℃ 10min，4 ℃10min。以制備的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參，實時熒光定量PCR法在Roche定量PCR儀上進行擴增，miR－21 上 游 引 物 為：5′－AAAGTTGTAGTCAGACTATTCGAT－3′，下游引物為：5′－GCTGTCAACGATACGCTACGT－3′。所有樣品做3個復孔，總反應體系20μL，設定反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性5s，55℃退火5s，72℃延伸15s。按照文獻［9］比較閾值法，讀取Ct值，用公式2－△△Ct計算目的基因miR－21的表達水平。△△Ct＝（實驗組 Ct目的基因－ 實驗組 Ct管家基因）－ （對照組Ct目的基因－對照組Ct管家基因）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料結(jié)果用表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

化療前B－ALL組miR－21表達水平高于對照組，差異有顯著性（t＝20.75，P＜0.05）；B－ALL高危型組 miR－21表達水平為8.65±0.47，明顯高于標危型組（5.23±0.35），差異有顯著性（t＝23.23，P＜0.05）；化療耐藥組 miR－21表達水平明顯高于化療敏感組，差異有顯著性（t＝10.12，P＜0.05）。化療后B－ALL組、化療敏感組miR－21表達水平較化療前明顯減低，差異有顯著性（t′＝10.56，t＝13.57，P＜0.05）；化療耐藥組化療前后 miR－21表達水平差異無顯著性（P＞0.05）。見表1。

表1 各組miR－21表達水平比較（）

表1 各組miR－21表達水平比較（）

化療前 化療后對照組 12 2.85±0.98 B－ALL組 36 7.06±0.43 5.24±0.94化療敏感組 30 6.69±0.49 4.59±0.61化療耐藥組組別 n 6 8.92±0.24 8.49±0.67

3 討 論

白血病發(fā)病存在細胞增殖失控、分化障礙及凋亡抑制等生物學特點，造血細胞惡性增殖、凋亡受抑是白血病發(fā)病的主要病理學機制，并決定著白血病病兒的臨床預后［10］？目前普遍認為，miRNA與腫瘤細胞的增殖密切相關，這其中尤以miR－21的研究較多。由于miR－21是目前公認的具有致癌作用的miRNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮樞紐調(diào)控效應。已有研究結(jié)果表明，miR－21的過度表達與白血病、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和各種非血液系統(tǒng)實體腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的能力和疾病預后有密切關系［6－8，11－15］；抑癌基因程序性細胞死亡因子4（PDCD4）可能是miR－21的靶基因，過表達的 miR－21能夠抑制PDCD4表達，從而促進腫瘤細胞分化和增殖，并可誘導腫瘤細胞發(fā)生侵襲、血管浸潤和轉(zhuǎn)移［12－14］。進一步的研究結(jié)果顯示，miR－21很可能是腫瘤耐藥的關鍵因素，與腫瘤預后密切相關，反義抑制miR－21能夠增加化療藥物對腫瘤細胞生長抑制［13］。其機制可能與 miR－21靶向作用PTEN，抑制P13K信號通路活化有關［16］。

本文研究結(jié)果顯示，B－ALL病兒miR－21表達明顯增高，其中高危型組miR－21表達明顯高于標危型組，化療后miR－21表達較化療前降低，與文獻結(jié)果相符，提示miR－21在兒童B－ALL的發(fā)病中發(fā)揮著重要的致癌基因作用。本文研究結(jié)果還顯示，B－ALL病兒化療后miR－21表達水平降低，以化療敏感組最為明顯，化療耐藥組miR－21表達化療前后無明顯改變；化療耐藥組化療前miR－21表達顯著高于化療敏感組，提示miR－21過表達可能為兒童B－ALL的不良預后指標，與兒童B－ALL疾病預后有密切關系，miR－21過表達與兒童B－ALL白血病細胞增殖、轉(zhuǎn)移能力以及疾病預后有密切關系，可作為兒童B－ALL預后判斷指標。但具體的機制有待進一步探討。

綜上所述，miR－21通過對靶基因的調(diào)控調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡，其表達增高參與了腫瘤細胞的侵襲、血管浸潤和轉(zhuǎn)移，miR－21靶向藥物可能成為治療腫瘤的一種行之有效的方法，與抗腫瘤藥物聯(lián)合應用將是腫瘤治療的一個新方向，也是提高療效的關鍵。

［1］TURNER M L，SCHNORFEIL F M，BROCKER T.Micro－RNAs regulate dendritic cell differentiation and function［J］.Journal of Immunology，2011，187（8）：3911－3917.

［2］SAYED D，ABDELLATIF M.MicroRNAs in development and disease［J］.Physiological Reviews，2011，91（3）：827－887.

［3］LU J，GETZ G，MISKA E A，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005（435）：834－838.

［4］ESQUELA－KERSCHER A，SLACK F J.Oncomirs－micro－RNAs with a role in Cancer［J］.Nature Reviews Cancer，2006（6）：259－269.

［5］ZHANG W Y，DAHLBERG J E，TAM W.MicroRNAs in tumorigenesis：aprimer［J］.The American Journal of Pathology，2007，171（3）：728－738.

［6］VAN DER FITS L，VAN KESTER M S，QIN Y J，et al.MicroRNA－21expression in CD4＋T cells is regulated by STAT3 and is pathologically involved in Sezary syndrome［J］.The Journal of Investigative Dermatology，2011，131（3）：762－768.

［7］YAMANAKA Y，TAGAWA H，TAKAHASHI N，et al.Aberrant overexpression of microRNAs activate AKT signaling via down－regulation of tumor suppressors in natural killercell lymphoma／leukemia［J］.Blood，2009，114（15）：3265－3275.

［8］MEDINA P P，NOLDE M，SLACK F J.OncomiR addiction in an in vivo model of micro RNA－21－induced pre－B－cell lym－phoma［J］.Nature，2010，467（7311）：86－90.

［9］SCHMITTGEN T D，LIVAK K J.Analyzing real－time PCR data by the comparative C（T）method［J］.Nature Protocols，2008，3（6）：1101－1108.

［10］SCHULER D，SZENDE B.Apoptosis in acute leukemia［J］.Leukemia Research，2004，28（7）：661－666.

［11］L?FFLER D，BROCKE－HEIDRICH K，PFEIFER G，et al.Interleukin－6dependent survival of multiple myeloma cells involves the Stat3－mediated induction of microRNA－21through a highly conserved enhancer［J］.Blood，2007，110（4）：1330－1333.

［12］ASANGANI I A，RASHEED S A，NIKOLOVA D A，et al.MicroRNA－21（miR－21）post－transcriptionally downregulates tumor suppressor PDCD4and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectal Cancer［J］.Oncogene，2008，27（15）：2128－2136.

［13］FRANKEL L B，CHRISTOFFERSEN N R，JACOBSEN A，et al.Programmed cell death 4（PDCD4）is an important functional target of the microRNA miR－21in breast cancer cells［J］.Journal of Biological Chemistry，2008，283（2）：1026－1033.

［14］LU Z，LIU M，STRIBINSKIS V，et al.MicroRNA－21promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4gene［J］.Oncogene，2008，27（31）：4373－4379.

［15］GU J Y，ZHU X J，LI Y M，et al.miRNA－21regulates arsenic－induced anti－leukemia activity in myelogenous cell lines［J］.Medical Oncology（Northwood，London，England），2011，28（1）：211－218.

［16］LEE J T JR，STEELMAN L S，MCCUBREY J A.Phosphatidylinositol 3’－kinase activation leads to multidrug resistance protein－1expression and subsequent chemoresistance in advanced prostate cancer cells［J］.Cancer Research，2004，64（22）：8397－8404.