通竅開玄法對(duì)鼻竇炎模型大鼠鼻黏膜影響的分子機(jī)制研究*

敬 櫻 趙 靜 張?zhí)於?羅再瓊

（成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137）

·研究報(bào)告·

通竅開玄法對(duì)鼻竇炎模型大鼠鼻黏膜影響的分子機(jī)制研究*

敬 櫻 趙 靜△張?zhí)於?羅再瓊

（成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137）

目的 應(yīng)用基因芯片技術(shù)觀察通竅開玄法對(duì)鼻竇炎模型大鼠鼻黏膜通路及基因表達(dá)的影響，探討其治療鼻竇炎的分子機(jī)制。方法 SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型組和正常組，實(shí)驗(yàn)組和模型組。依據(jù)Y.Gel的改良方法造模，正常組不做任何處理。造模成功后實(shí)驗(yàn)組分為中藥組與青霉素V鉀片組，分別予蒼耳子鼻炎膠囊、青霉素V鉀片灌胃，處死動(dòng)物，取鼻黏膜組織，應(yīng)用基因芯片檢測(cè)各組大鼠鼻黏膜基因表達(dá)，篩選差異表達(dá)基因和通路并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 中藥組與青霉素V鉀片組治療效果相似；中藥組和青霉素V鉀片組分別與模型組比較：中藥組得到的差異基因及通路改變均多于青霉素V鉀片組；兩組共同涉及13條通道，且共同上調(diào)8條基因、下調(diào)71條基因。結(jié)論 通竅開玄法對(duì)治療鼻竇炎大鼠存在物質(zhì)基礎(chǔ)，可為臨床治療鼻竇炎提供新的治療思路。

鼻竇炎 基因芯片 通竅開玄法 基因通路表達(dá)

玄府廣泛存在于鼻腔鼻竇的黏膜，其有序的開闔維持著氣液在鼻腔鼻竇黏膜的循環(huán)交通，保證了鼻腔鼻竇黏膜的正常形態(tài)及生理功能［1］。而外邪入侵、邪毒內(nèi)生郁阻鼻中竇竅與玄府，導(dǎo)致雙竅閉塞是鼻竇炎發(fā)病的重要機(jī)制。本課題組前期研究顯示，運(yùn)用通竅開玄法治療鼻竇炎模型大鼠效果顯著，但是未從基因水平探討其作用機(jī)制。因此，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，從基因水平探討開竅通玄法對(duì)鼻竇炎模型大鼠鼻黏膜作用的分子機(jī)制，揭示通竅開玄法治療鼻竇炎的生物學(xué)機(jī)制，為通竅開玄法提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試劑與儀器 蒼耳子鼻炎膠囊：四川禾邦制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格每粒裝0.4g，市售（人用量每次2粒，每日3次），據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量及動(dòng)物給藥原則計(jì)算藥物用量。青霉素V鉀片：市售［5～18.7mg/（kg·d）］。TRIZOL Reagent（Cat#15596-018，Life technologies，Carlsbad，CA，US）、RNeasyminiKit（Cat#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）、RNase-free DNase set（Cat#79254，QIAGEN，GmBH，Germany）、Low Input Quick Amp Labeling Kit（Cat#5190-2305，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US），One-Color、RNASpike-InKit（Cat#5190-2305，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）、One-Color、Gene Expression Kit（Cat#5188-5242，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）、Gene Expression Wash Buffer Kit（Cat#5188-5327，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）。AgilentBioanalyzer2100（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）、Hybridization oven（Cat#G2545A，Agilenttechnologies，SantaClara，CA，US）、staining dishes（Cat#121，Thermo Shandon，Waltham，MA，US）、Agilent Microarray Scanner（Cat#G2565CA，Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）。

1.3 造模與分組 實(shí)驗(yàn)SD大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參考相關(guān)文獻(xiàn)［2］的方法，隨機(jī)取30只大鼠，按0.5mg/kg腹腔注射氯胺酮全身麻醉，同時(shí)用利多卡因1.52～2.0mL（20mg/mL）配腎上腺素0.0125mg，鼻背下浸潤(rùn)麻醉，在面中線上中1/3交界處旁3mm以45度角作切口，塞入帶有金葡萄球菌的明膠海綿于內(nèi)，縫合切口，建立急性鼻竇炎大鼠模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 造模后第7日，將造模大鼠隨機(jī)分為中藥組、青霉素V鉀片組、模型對(duì)照組各10只。10只大鼠為正?？瞻讓?duì)照組。從造模成功后的第1日開始灌胃連續(xù)7d，每日各組均早晚兩次灌服。中藥組以相當(dāng)于臨床成人劑量10倍的藥物制成混懸液灌胃［即5mL/（kg·d）］；青霉素V鉀片組，每日以相當(dāng)于臨床成人劑量5倍的青霉素V鉀片制成混懸液灌胃［含藥量10mg/（kg·d）］。模型對(duì)照組以等量0.9％氯化鈉注射液灌胃。正常對(duì)照組不灌胃，常規(guī)喂養(yǎng)。于灌胃結(jié)束后次日處死大鼠，在超凈臺(tái)冰盤上摘取鼻黏膜組織，無(wú)Rnase PBS緩沖液沖洗兩次，放入凍存管，置液氮罐保存，備提取RNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書RNeasymini kit（Cat#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）和RNase-Free DNase Set（Cat#79254，QIAGEN，GmBH，Germany）提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的總RNA抽提，并純化總RNA，經(jīng)安捷倫2100芯片生物分（Agilenttechnologies，Santa Clara，CA，US）電泳質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的RNA進(jìn)行單熒光標(biāo)記，利用Agilent大鼠全基因4×44K芯片檢測(cè)，依次進(jìn)行芯片雜交、洗滌，采用安捷倫芯片掃描儀進(jìn)行掃描獲取熒光信號(hào)。用Feature Extraction software 10.7（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）采轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)為數(shù)值，最后采用Gene Spring Software 11.0進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile，獲取各組基因表達(dá)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Excel計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組基因表達(dá)ratio值，通常設(shè)定差異倍數(shù)的閾值為小于0.5或大于2為基因差異評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，大于2表示基因上調(diào)2倍，小于0.5表示基因下調(diào)2倍。分析顯示，實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比：中藥組得到4583條差異基因，青霉素V鉀組得到352條差異基因。

2 結(jié)果

2.1 聚類分析 利用斯坦福大學(xué)Clustr和Treeview軟件，過(guò)濾數(shù)據(jù)，以At least 1 observations with abs=4.0，MaxVal-MinVal＞=1.0可以清楚看到cDNA微陣列中8676個(gè)基因在中藥組（ARRY0X）、青霉素V鉀片組（ARRY01X）、模型組（ARRY02X）和空白組（ARRY03X）比較后的基因表達(dá)情況，其中每個(gè)小格代表一個(gè)基因，黑色表示無(wú)差異，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)，顏色的變化程度與基因表達(dá)的差異性成正比。從圖1中可以看出中藥組和青霉素V鉀片組聚類，說(shuō)明中藥組治療鼻竇炎大鼠與青霉素V鉀片組治療效果相似。

圖1

2.2 開竅通玄法所涉及差異表達(dá)基因參與通路分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)基因生物學(xué)通路，中藥組差異基因涉及278條通路改變，青霉素V鉀片組差異基因涉及193條通路改變，主要包括炎癥發(fā)生、抗原提呈、補(bǔ)體等免疫學(xué)通路等。涉及通路名稱及基因條數(shù)如表1所示。從表1可看出，兩組差異表達(dá)基因涉及相同的通路，也涉及不同的通路，在同一通路中，表達(dá)的基因條數(shù)也不同。

表1 兩組差異表達(dá)基因分別涉及通路改變及基因數(shù)目表

2.3 開竅通玄法所涉及差異基因的功能分析 本研究采用Babelomics 4.3數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，對(duì)兩組差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO生理過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）分析，兩組間參與BP差異表達(dá)基因數(shù)量百分比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義如圖2、圖3所示（P＜0.05）；兩組中共有基因表達(dá)差異比較如表2、3所示；兩組的差異表達(dá)基因共同BP如表2、3所示。

圖2 兩組上調(diào)差異基因共同參與生理過(guò)程分析圖

圖3 兩組下調(diào)差異基因共同參與生理過(guò)程分析圖

表2 兩組中共有上調(diào)基因差異表達(dá)值表

3 討論

鼻中玄府作為遍布鼻腔、鼻竇的一種微觀結(jié)構(gòu)，維持著鼻部氣液的流通、神機(jī)的運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)于保證鼻的功能至關(guān)重要。不論外邪的侵襲，七情的失調(diào)，飲食勞倦所傷，氣血津液失養(yǎng)，均可影響其正常的暢通而致閉密，成為鼻部諸多疾病所共有的基本病理變化。鼻竇竇竅與鼻玄府的雙重閉塞、內(nèi)外雙毒交互搏結(jié)是形成鼻竇炎的主要原因。治療上應(yīng)以通竅開玄，以“通鼻竅、開玄府”為治療原則。蒼耳子鼻炎膠囊主要成分為蒼耳子，其為風(fēng)藥，可辛散透達(dá)、開泄宣通，具有開啟腠理孔竅、宣通郁結(jié)閉塞之功，能疏通各種瘀滯，使郁閉之孔竅開張暢達(dá)，阻滯之氣血津液精神暢通，從而可有效治療鼻竇炎。

表3 兩組中共有下調(diào)基因差異表達(dá)值表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥組和青霉素V鉀片均可上調(diào)syndecan-4（Sdc4）基因，下調(diào)ALOX5、S100A8、S100A9基因，但中藥組上下調(diào)表達(dá)更明顯。syndecan-4可獨(dú)立通過(guò)激活PKCa激活小G蛋白R(shí)ho（ras homologus oncogenes）超家族（包括RhoA、Racl、RhoG等），調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白重排。syndecan-4多聚化并激活PKCa后，可促使Rho二磷酸鳥苷解離抑制因子（RhoGDI）中Ser96磷酸化，釋放與之結(jié)合的RhoG并激活Racl［3］。Rac蛋白的SH3區(qū)通過(guò)與波形蛋白相互作用，激活肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3（Arp2/3）復(fù)合體，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白（actin）聚合，參與細(xì)胞移行過(guò)程中片狀偽足的形成；而釋放的RhoG可以促使整合素α5β1內(nèi)吞，抑制細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞移行和創(chuàng)傷組織修復(fù)［4］。除了肌動(dòng)蛋白外，α-輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin）作為細(xì)胞骨架的重要組成部分可直接與syndecan4胞內(nèi)段的V區(qū)關(guān)聯(lián)，影響微絲束的重組，調(diào)控細(xì)胞的黏附和移行［5］。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，經(jīng)過(guò)中藥組治療后上調(diào)syndecan-4（Sdc4）基因的表達(dá)，促進(jìn)激活RhoG，從而抑制了細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞移行和創(chuàng)傷鼻黏膜組織修復(fù)過(guò)程。

ALOX5基因編碼的花生四烯酸5-脂氧合酶（5-LO）是炎癥介質(zhì)白三烯（LTs）生成旁路的一個(gè)起始催化酶，在炎癥、老年性癡呆、腫瘤和過(guò)敏等疾病中5-LO的活性及其表達(dá)通常升高，使LTs類代謝產(chǎn)物的生物合成增加，LT產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，花生四烯酸在5-LO及5-脂氧合酶激活蛋白（5-FLAP）的作用下轉(zhuǎn)化為5-過(guò)氧化氫廿碳四烯酸（5-HPEIE），5-HPEIE在酶的催化作用下依次生成LTA4、LTB4、LTC4、LTIM，LTIM進(jìn)一步代謝為半胱氨酸衍生物L(fēng)TE4［6］。白三烯是引起支氣管哮喘發(fā)生重要的炎癥介質(zhì)［7］，由嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞生成，它可以引起氣道平滑肌收縮和增生，促使嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集，釋放陽(yáng)離子蛋白損傷上皮細(xì)胞，增加黏液分泌，降低纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)能力，增加血管通透性，促進(jìn)氣道重塑［8］。

S100A8/S100A9的主要功能是抑制酪蛋白激酶（casein kinase）I和Ⅱ的活性，酪蛋白激酶I和Ⅱ是正常轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中分子水平磷酸化必不可少的［9］。S100A9在炎癥部位通常和S100A8形成一種穩(wěn)定的異源二聚體（S100A8/A9），對(duì)炎癥灶周圍的白細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用［10］。蒼耳子鼻炎膠囊通過(guò)上調(diào)syndecan-4（Sdc4）基因，下調(diào)ALOX5、S100A8、S100A9基因可能是治療鼻竇炎機(jī)制之一。

綜上可見，本次實(shí)驗(yàn)利用基因芯片首次對(duì)通竅開玄法治療鼻竇炎大鼠的分子機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)蒼耳子鼻炎膠囊與青霉素V鉀片治療鼻竇炎大鼠具有相似的實(shí)驗(yàn)效果。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，二者既通過(guò)不同的生物學(xué)通路和基因發(fā)揮作用，又通過(guò)相同生物學(xué)過(guò)程與同一基因的差異表達(dá)調(diào)控發(fā)揮作用，但是中藥組表達(dá)調(diào)控更強(qiáng)更廣一些，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)調(diào)控和作用成分復(fù)雜特點(diǎn)?？傊?，蒼耳子鼻炎膠囊能在基因表達(dá)水平，從多途徑、多環(huán)節(jié)、整體上調(diào)控炎癥過(guò)程，揭示其治療鼻竇炎的生物學(xué)基礎(chǔ)，充分證明了開竅通玄法的科學(xué)性，為防治鼻科疾病開辟了新途徑。

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Effects of Tongqiaokaixuan Method on the Molecular Mechanism of Nasal Mucosa in Sinusitis Rat Model

JING Ying，ZHAO Jing，ZHANG Tiane，et al.
Chengdu University of TCM，Sicuan，Chengdu 611137，China

Objective：To observe the effect of Tongqiaokaixuan method on the gene passway and expression of nasal mucosa in sinusitis rat model by the technique of gene chip.Methods：SD rats were randomly divided into experimental groups，model group and normal group.Experimental groups and model group adopted Y.Gel improved model while normal group changed nothing.After success of model building，experimental groups were given Xanthium rhinitis capsule and Penicillin V potassium tablets respectively by gavage.Then the rats were put to death.Nasal mucosal tissue extracts were detected by gene chip to show the gene expressions.Differentially expressed genes and pathways were screened and statistically analyzed.Results：Penicillin V potassium tablets group and TCM group shared some similarities.TCM group changed more of gene expressions and passways than penicillin V potassium tablets group.The two groups have 13 common passways in physiological processes，and the common process raised 8 genes and decreased 71 genes.Conclusion：Tongqiaokaixuan method has certain effect on rats with sinusitis thus provides new way for clinical treatment of sinusitis.

Sinusitis；Gene chip；Tongqiaokaixuan method；Gene passway

R765.4+1

A

1004-745X（2014）10-1773-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.001

2014-05-19）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072737）；成都中醫(yī)藥大學(xué)?；鹳Y助項(xiàng)目（ZRYB200924）

△通信作者