基于Bcl-2/Bax研究大柴胡湯合承氣湯恢復(fù)重癥胰腺炎腸黏膜屏障的作用*

趙星海 陳 暉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬昆山市中醫(yī)院，江蘇 昆山 215300）

基于Bcl-2/Bax研究大柴胡湯合承氣湯恢復(fù)重癥胰腺炎腸黏膜屏障的作用*

趙星海 陳 暉△

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬昆山市中醫(yī)院，江蘇 昆山 215300）

目的 通過測定模型大鼠腸黏膜Bcl-2、Bax的含量，研究大柴胡湯合承氣湯恢復(fù)重癥胰腺炎腸黏膜屏障的作用。方法 將健康SD大鼠100只隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組，大柴胡湯合承氣湯低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組，測定腸黏膜Bcl-2、Bax含量。結(jié)果 高劑量組Bcl-2陽性率顯著高于模型組（P=0.004），中劑量組Bcl-2陽性率高于模型組（P=0.022），低劑量組的Bcl-2陽性率與模型組相仿（P=0.168）；高劑量組Bax陽性率低于模型組（P=0.010），中、低劑量組Bax陽性率與模型組相仿（P=0.113，P=0.342）。結(jié)論 大柴胡湯合承氣湯治療重癥胰腺炎，可以減少腸黏膜細(xì)胞的凋亡，從而起到恢復(fù)腸黏膜屏障的作用。

重癥胰腺炎 Bcl-2/Bax 大柴胡湯 承氣湯 腸黏膜屏障

重癥急性胰腺炎（SAP）病情危重，進(jìn)展快而變化多端，并發(fā)癥多、病死率高而嚴(yán)重威脅患者生命［1-2］。目前研究表明，SAP時(shí)的微循環(huán)障礙是胰腺及胰外器官損害的重要原因之一，而胃腸道又是最易受累的胰外器官之一，腸黏膜屏障功能受損，會加重疾病的發(fā)展，增加死亡率，腸上皮細(xì)胞凋亡的增加是腸屏障功能減弱的主要原因，故減少腸上皮細(xì)胞凋亡可以恢復(fù)腸屏障功能，減少SAP的死亡率，提高臨床治愈率［3］。本研究從中醫(yī)基礎(chǔ)理論出發(fā)，使用大柴胡湯合承氣湯，通過測定模型大鼠腸黏膜Bcl-2/Bax的含量，研究大柴胡湯合承氣湯恢復(fù)重癥胰腺炎腸黏膜屏障的作用，為治療SAP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量（150±10）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 藥劑 柴胡10g，黃芩10g，芍藥30g，制半夏10g，生姜3片，枳實(shí)1g，大黃6g，黃連6g，厚樸10g，大棗6枚，制備成中藥制劑，濃度含生藥0.45g/mL。

1.3 造模 給予大鼠3％戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉成功后，固定于手術(shù)臺上，頸部、腹部和腹股溝處去毛，消毒皮膚，鋪無菌孔巾，取上腹部正中切口，切開皮膚、皮下及腹白線，保護(hù)切口，找到并提起十二指腸，顯露胰膽管的全程，近十二指腸處膽管用無創(chuàng)傷性動脈夾夾閉。以磨鈍、稍彎曲的4.5號針頭從胰膽管靠肝門處穿刺胰管，向胰管內(nèi)注射3.5％牛磺膽酸鈉（0.1mL/100g，0.2mL/min），穿刺完畢后立即用一小動脈夾夾閉穿刺處、以防胰瘺。5min后見整個胰腺明顯充血、水腫、片狀出血，證實(shí)急性胰腺炎動物模型成立，移去兩小動脈夾，將腸管歸復(fù)原位，4號絲線分層連續(xù)縫合切口，關(guān)閉腹腔。

1.4 用藥 空白對照組不給任何藥物；模型對照組給予0.9％氯化鈉注射液20ml/kg/次灌胃；治療低劑量組（含生藥0.15g/mL）每次20mL/kg灌胃；治療中劑量（含生藥0.30g/mL）每次20mL/kg灌胃；治療高劑量（含生藥0.45g/mL）每次20mL/kg灌胃。

1.5 給藥及取材方法 治療組分別于造模前2h、造模后1h、3h予中藥灌胃。對照組和模型組均于相同時(shí)間點(diǎn)予等量的0.9％氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠分別分批于造模后24h取材，取小腸腸組織清洗后固定。

1.6 腸黏膜組織Bcl-2、Bax蛋白的檢測 運(yùn)用免疫組化SP法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。陽性標(biāo)準(zhǔn)：Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色著色顆粒狀，參照CAIDE等的計(jì)數(shù)方法，放大400倍鏡下計(jì)數(shù)5個視野，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100％。陽性細(xì)胞數(shù)5％～25％為（+），陽性細(xì)胞數(shù)在26％～50％為（++），陽性細(xì)胞數(shù)在51％～75％為（+++），陽性細(xì)胞數(shù)＞75％為（++++）；陰性（-）指無角質(zhì)形成細(xì)胞著色或角質(zhì)形成細(xì)胞著色＜5％。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腸黏膜Bcl-2蛋白的表達(dá) 見表1。高劑量組的陽性率顯著高于模型組（P=0.004），中劑量組的陽性率高于模型組（P=0.022），低劑量組的陽性率與模型組相仿（P=0.168）。

表1 各組大鼠腸黏膜Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.2 各組大鼠腸黏膜Bax蛋白的表達(dá) 見表2。高劑量組的陽性率低于模型組（P=0.010），中、低劑量組的陽性率與模型組相仿（P=0.113，P=0.342）。

表2 各組大鼠腸黏膜Bax蛋白的表達(dá)

3 討論

SAP時(shí)，由于活性氧（ROS）、炎性介質(zhì)（包括細(xì)胞因子）和內(nèi)毒素等多重因素作用，腸黏膜屏障功能受損，腸黏膜屏障在SAP的發(fā)展轉(zhuǎn)歸起著舉足輕重的作用，通過減少腸道上皮細(xì)胞的凋亡來干預(yù)腸黏膜屏障成為防治的理想選擇［4］。

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（Bcl-2）家族的成員是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子。Bcl-2蛋白家族細(xì)胞凋亡抑制因子有Bcl-2、Bcl-XL等；細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子有Bax等。Bcl－2家族是最著名的致/抗凋亡基因家族，它主要通過直接調(diào)節(jié)CytoC的釋放和線粒體的能量轉(zhuǎn)換來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；此外，也能通過調(diào)節(jié)caspases發(fā)揮作用。Bax表達(dá)增加時(shí)，形成同源二聚體可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2表達(dá)上升時(shí)，其可以競爭性地與Bax形成異源二聚體，從而抑制Bax-Bax同源二聚體所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax蛋白水平的高低與凋亡調(diào)控有直接相關(guān)性，Bcl-2增高抑制細(xì)胞凋亡，Bax增高則促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為SAP屬“痹心痛”、“結(jié)胸”等范疇，病因多由外邪侵襲，暴飲暴食或膽管阻塞，肝氣郁積，肝氣橫逆而生內(nèi)毒，邪氣蘊(yùn)積，終致氣滯、腑氣痞塞而生諸證。本研究依據(jù)其中醫(yī)發(fā)病機(jī)制，選用具有理氣止痛、通里攻下功用的《傷寒論》經(jīng)典方大柴胡湯合承氣湯，方中重用柴胡為君藥，配臣藥黃芩、黃連和解清熱，以除少陽之邪；輕用大黃配枳實(shí)、厚樸以內(nèi)瀉陽明熱結(jié)，行氣消痞，亦為臣藥。芍藥柔肝緩急止痛，與大黃相配可治腹中實(shí)痛，與枳實(shí)相伍可以理氣和血，以除心下滿痛；半夏和胃降逆，配伍大量生姜，以治嘔逆不止，共為佐藥。大棗與生姜相配，能和營衛(wèi)而行津液，并調(diào)和脾胃，功兼佐使。該方治療SAP模型大鼠，能夠提高腸黏膜Bcl-2蛋白的含量，減少腸黏膜Bax蛋白的含量，從而達(dá)到減少腸黏膜細(xì)胞凋亡的目的，起到恢復(fù)腸黏膜屏障的作用，對SAP有一定的治療作用。

［1］Mentula P，Leppniemi A.Position paper：timely interventions in severe acute pancreatitis are crucial for survival［J］.World J Emerg Surg，2014 Feb，10；9（1）：15.

［2］ Haney JC，Pappas TN.Necrotizing pancreatitis：diagnosis and management［J］.Surg Clin North Am，2007；87（10）：1431-1446.

［3］ Sun X，Shao Y，Jin Y.Melatonin reduces bacterial translocation by preventing damage to the intestinal mucosa in an experimental severe acute pancreatitis rat model［J］.Exp Ther Med，2013 Dec，6（6）：1343-1349.

［4］ Lu Y，Yu Y，Yang M.Protective effects of saizen in combination with stilamin on intestinal mucosa of a rabbit model of severe acutepancreatitis［J］.Pancreas，2013 Jan，42（1）：102-107.

［5］ Coleman CB，McGraw JE，F(xiàn)eldman ERA.Gammaherpesvirus Bcl-2 ortholog blocks B cell receptor-mediated apoptosis and promotes the survival of developing B cells in vivo［J］.PLoS Pathog，2014 Feb 6，10（2）：1-19.

Research on the Role of Dachaihu Decoction Combined with Chengqi Decoction Restoring Intestinal Mu-cosal Barrier in Patients with Severe Pancreatitis Based Bcl-2/Bax

ZHAO Xinghai，CHEN Hui.
Kunshan TCM Affilated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Kunshan 215300，China

Objective：To study the effect of Dachaihu decoction and Chengqi decoction restoring intestinal mucosal barrier of patients with severe pancreatitis by determining the content of Bcl-2 and Bax of intestinal mucosa.Methods：SD rats were randomly divided into blank control group，model control group，low-dose treatment group，medium-dose treatment group and high-dose treatment group.Bcl-2 and Bax contents in intestinal mucosa were measured.Results：Bcl-2 positive rate in high-dose group was significantly higher than that in model group（P=0.004），Bcl-2 positive rate in medium-dose group was higher than that in model group（P=0.022）.Bcl-2 positive rate of low-dose group was similar to that of model group（P=0.168）.Bax positive rate of high-dose group was lower than that of model group（P=0.010）.Bax positive rates in medium and low-dose groups were similar to that of model group（P=0.113，P=0.342）.Conclusion：Dachaihu decoction and Chengqi decoction treating severe pancreatitis can reduce apoptosis in intestinal cells，thus play a role in restoring the intestinal mucosal barrier.

Severe pancreatitis；Bcl-2/Bax；Dachaihu decoction；Chengqi decoction；Mucosal barrier

R657.5+1

B

1004-745X（2014）10-1841-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.027

2014-07-10）

江蘇省昆山市2014年市級指令性課題

△通信作者