突破極限，見所未見
——2014年諾貝爾化學獎側記

譯/石 毅

突破極限，見所未見
——2014年諾貝爾化學獎側記

譯/石 毅

2014年諾貝爾化學獎得主（左）艾力克·貝齊格（Eric Betzig），（中）斯特凡·W·赫爾（Stefan W.Hell），（右）W·E·莫納（W.E.Moerner）。

2014年諾貝爾化學獎給了三個物理學家：艾力克·貝齊格（Eric Betzig）、斯特凡·W·赫爾（Stefan W.Hell）和W·E·莫納（W.E.Moerner），以表彰他們對于發展超分辨率熒光顯微鏡做出的卓越貢獻。他們的突破性工作使光學顯微技術進入了納米尺度，從而使科學家們能夠觀察到活細胞中不同分子在納米尺度上的運動。

這三位獲獎科學家都是業內知名人士，很有知名度。貝齊格是美國應用物理學家和發明家，目前在美國霍華德·休斯醫學研究所珍利亞農場研究園區工作；赫爾是羅馬尼亞出生的德國物理學家，現在擔任德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所所長；莫納則是美國單分子光譜和熒光光譜領域的著名專家，從1998年至今一直在斯坦福大學擔任教授。

光學顯微鏡及其分辨率限制

為什么說這三位獲獎者的工作是突破性的呢？

故事得從光學顯微鏡說起。隨著黑暗的中世紀結束，歐洲進入文藝復興時期。在文化藝術得到極大發展的同時，現代自然科學也慢慢發展起來：第一臺光學顯微鏡正是在文藝復興時期問世。是誰制造了第一臺光學顯微鏡已不完全可考（一說是兩個荷蘭的眼鏡制造商于16世紀晚期發明），但這不重要。重要的是，從此以后科學家們可以用光學顯微鏡來瞧瞧這個瞅瞅那個了，觀察的對象當然也包括各種生命有機體。在那個時代，隨便看看樹葉小草也是個重量級的大發現：著名的羅伯特·胡克（Robert Hooke）先生就是在1665年用光學顯微鏡看了看紅酒瓶的軟木塞從而發現了細胞的存在?，F代生物學及微生物學皆因光學顯微鏡而誕生，光學顯微鏡也成為生命科學中必不可少的工具。隨著人們觀測的東西越來越小，人們不禁疑問，光學顯微鏡到底能看多小？

“能看多小”換成比較科學的說法就是“分辨率有多高”。分辨率（嚴格講是光學分辨率）描述的是成像系統解析成像細節能力，或者說是成像系統能區分的兩點之間的最小距離。1873年，物理學家恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）得出結論：傳統的光學顯微鏡分辨率有一個物理極限，即所用光波波長的一半（大概是0.2微米，即200納米）。

為什么會這樣呢？要理解這個，我們回到高中物理曾經介紹過的單縫衍射實驗：當一束光經過一條狹縫，在中間亮條紋的兩側會出現一系列明暗交替的條紋。這是因為光是電磁波，它被狹縫限制時會發生衍射從而偏離直線傳播。如果光經過的不是一條狹縫，而是一個圓孔，那么圓孔會在各個方向上限制光的傳播，從而光在各個方向上發生衍射而形成圓孔衍射圖樣，或者叫“愛里斑”（Airy Disk）：這個圖案中心有一個比較大的亮斑，外圍有一些明暗交替的環。同樣的道理，由于衍射的存在，成像系統無法把光線匯聚成無限小的點，而只會在像平面上形成有限大小的愛里斑。通過任何光學儀器成像的過程，都可以認為是把物平面上的無數微小的點轉換成愛里斑，然后再把它們疊加起來呈現在像平面上。這樣的結果是，任何成像系統所得到的像無法精確地描述物體的所有細節。

那么像平面上能夠呈現多精細的細節？假如物平面上有兩個點，通過一個光學成像系統后產生兩個愛里斑。當這兩個點離得較遠時，像平面上的愛里斑也會離得較遠——此時我們可以輕松分辨出物平面上有兩個點。如果把兩個點逐漸移近，愛里斑也會隨之接近。當它們接近到一個圓斑中心與另一個圓斑邊緣重合的時候，我們達到能夠分辨出有兩個點的極限（這就叫瑞利判據）。如果這兩個點更接近，像平面上的兩個愛里斑就幾乎重合在一起，成為一個圓斑，那物平面上的兩個點就不可分辨了。因此，愛里斑的直徑就給出了理想光學系統的最高分辨率；在光學顯微鏡中，這個數值大概是光波波長的小一半，0.2微米或200納米。

（A），（B）愛里斑；（C）分辨率及瑞利判據。

很長時間以來，人們都認為光學顯微技術無法突破這個極限。為了達到更高的分辨率，很多人選擇了其他顯微技術，如電子顯微鏡（分辨率能達到0.2納米）。事實上，電子顯微鏡也是遵循衍射規律的。不同的是電子波長比光波短1 000倍，從而分辨率更高。然而，電子顯微鏡有一個很明顯的缺點：它很難用于活體生物樣品的觀察；相反地，光學顯微鏡對于觀察的樣品基本沒有侵略性。

超分辨率熒光顯微鏡的原理

這三位科學家是如何突破光學顯微鏡的分辨率極限呢？

首先登場的是莫納。超分辨率熒光顯微鏡很重要的一個方面是熒光。熒光是一種光致冷發光現象。熒光分子能夠吸收一種波長的光，放射出另外一種波長的光。熒光分子是有一定壽命的，其持續發光一段時間后，將不能繼續發光（這種現象叫作光致褪色）。熒光分子可以是熒光蛋白質分子（如2008年諾貝爾化學獎得主錢永健發現的綠色熒光蛋白），也可以是有機分子。在莫納之前，人們觀測熒光分子時都是同時觀測到幾百萬幾千萬個分子，得到的結果是其平均統計結果。而莫納是第一個能夠探測單個熒光分子的人，于1989年將技術推進到觀測單個熒光分子。能夠探測并觀察單個熒光分子對于超分辨率顯微鏡極其重要。雖然單個熒光分子成像后也是一個0.2微米的愛里斑，但是在沒有其他分子存在的情況下，它的中心位置可以更精確地被確定下來的。這就好比一座山峰直徑很大，但是峰頂的位置卻能輕松地測量。在一定條件下，單個熒光分子的定位精度能達到1納米。這是超分辨率顯微鏡的基礎。

莫納的另一個貢獻是發現了像控制電燈泡一樣方便地控制熒光蛋白發光的方法：一些已褪色的熒光蛋白在照射405nm激光后能夠被激活，再照射其激發光（如488nm）即可重新發出熒光；這個方法稱為“光激活（photoactivation）”。

貝齊格發明的超分辨率顯微鏡叫光激活定位顯微鏡（photoactivated localization microscopy，PALM），其中所利用的就是莫納發現的光激活方法。貝齊格利用微量的405nm激光照射樣品，使得其中極小部分熒光分子能夠發出熒光。由于這些發光的熒光分子很稀疏從而相距較遠，它們的位置能夠精確地確定下來。等這些分子光致褪色后，再次照射405nm激光而激活另一小部分熒光分子。重復這個過程即可將樣品中的所有分子定位出來，從而得到整個樣品的圖像。

溶酶體膜在不同顯微鏡下的成像結果（左）傳統光學顯微鏡成像；（中）光激活定位顯微鏡成像；（右）放大的光激活定位顯微鏡成像。注：0.2微米刻度相當于阿貝衍射極限，分辨率得到很大改善。

赫爾則另辟蹊徑，他發明的是STED（受激發射損耗，stimulated emission depletion）熒光成像技術。在這個技術中，雖然激發光脈沖能夠激發0.2微米區域內的所有熒光分子，但是另一種甜甜圈形狀的激光能將其照射區域的所有分子的熒光消除，從而只留下中間的分子的熒光。通過掃描整個樣品，從而實現對整個樣品的成像。

華人科學家莊小威的工作

值得一提的是，幾乎與貝齊格2006年發明PALM同時，哈佛大學化學系與物理系的華人教授莊小威也獨立發明了另一種超分辨率顯微鏡（STORM，stochastic optical reconstruction microscopy）。PALM和STORM這兩種顯微技術不僅同年，而且原理也基本一致。不同之處在于貝齊格利用的是光激活蛋白，而莊小威使用的是有機熒光分子對。但很遺憾的是，莊小威并未能分享2014年的諾貝爾化學獎。

另一片天空

今天，科學家們能夠從最微小的分子細節來研究活細胞，這在前人看來是不可能的事情。在納米顯微（nanoscopy）領域，科學家可以觀察到更小的結構，也可以觀測活細胞中不同分子的運動——他們能夠看到腦部神經細胞間的突觸是如何形成的，他們能夠觀察到與帕金森氏癥、阿爾茲海默癥和亨丁頓舞蹈癥相關的蛋白聚集過程，他們也能夠在受精卵分裂形成胚胎時追蹤不同的蛋白質。這無疑將推動人類從分子水平理解生命科學中的現象與機理。

來源：nobelprize.org