液相色譜－串聯質譜聯用法測定心腦欣片中甜菜堿含量

趙 勇 ，王 艷 ，丁 野 ，鄭金鳳 ，李文莉

（1．湖南省食品藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001； 2．湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

心腦欣片由紅景天、枸杞子和沙棘鮮漿3味藥材組方，具有益氣養陰、活血化瘀之功效，用于氣陰不足、瘀血阻滯引起的頭暈、頭痛、心悸、氣喘、乏力，以及缺氧引起的紅細胞增多癥見上述證候者。其現行質量標準（國家食品藥品監督管理局標準YBZ02242009）中無枸杞子含量測定項。枸杞子作為方中臣藥，所含甜菜堿是枸杞子中主要生物堿之一，能調節體內滲透壓，促進脂肪代謝和蛋白質合成，是體內高效的甲基供體。2010年版《中國藥典（一部）》收載了枸杞子生品中甜菜堿含量測定的薄層掃描法[1]，但該法操作復雜、重復性差、誤差大。文獻[2－3]報道，采用高效液相色譜（HPLC）法在低波長或將甜菜堿衍生化后進行含量測定[2－3]，但前者靈敏度低、噪音大，而后者煩瑣且反應不完全，測量結果有誤差。本試驗中建立了測定心腦欣片中甜菜堿含量的液－質聯用法，方法簡便、快速、靈敏度高、重復性好、實用性強，為進一步控制該藥品的質量提供了技術支撐。

1 儀器與試藥

Xevo TQ－S型液相色譜－串聯質譜聯用儀（美國Waters公司）；CG－300型超聲波清洗儀(300 W，25 kHz)。甜菜堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為 110894－200503，供含量測定用）；心腦欣片（國內某企業提供）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果[4－8]

2．1 色譜及質譜條件

色譜柱：Venusil HILIC 柱(100 mm ×2．1 mm，3 μm）；流動相：乙腈 － 水(80 ∶20)；流速：0．3 mL ／min；柱溫：35 ℃；進樣量：3 μL。離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子化模式：正離子模式（positive）；多反應監測（MRM）；源電壓4 kV；毛細管溫度：400℃；錐孔電壓：35 V；鞘氣流速：800 L ／h；以 118．20→57．92 和 118．20→59．00為定量離子對，碰撞能量25 V。

2．2 溶液制備

精密稱取甜菜堿對照品11．10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取質量差異項下的本品，除去包衣，精密稱定，研細，取約0．2 g，精密稱定，置 100 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方稱取除枸杞子外的其他藥材，按樣品制備工藝制成缺枸杞子的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成缺枸杞子的陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

陰性干擾試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各3 μL，依法測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜主峰保留時間的相應位置有相一致的色譜峰，缺枸杞子的陰性對照品溶液色譜則無此峰，表明陰性對照無干擾（圖1）。

圖1 甜菜堿多反應監測（MRM）圖

線性關系考察：分別精密吸取甜菜堿質量濃度為4．44，17．76，53．28，88．80，142．08，177．6 ng ／mL 的對照品溶液各 3 μL，依法測定，以峰面積積分值為縱坐標、對照品質量濃度（ng／mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝13 605 X－25 320，r＝0．999 9（n＝6）。結果表明，甜菜堿進樣質量濃度在 4．44～177．6 ng／mL范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

儀器檢出限確定：精密吸取質量濃度為4．44 ng／mL的對照品溶液3 μL，依法測定。結果信噪比為 74．2時，折算儀器檢出限為 0．2 ng ／mL。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液3 μL，連續進樣6次。結果甜菜堿峰面積的 RSD為1．5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品（批號110901），依法制備6份供試品溶液并測定含量。結果平均含量為 2．245 5 mg／g，RSD為1．3%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于配制后 0，3，7，10，15，24 h時精密吸取 3 μL，依法測定。結果甜菜堿峰面積的 RSD為1．2%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：稱取已知含量的同一批(批號為110901)樣品(含甜菜堿 2．245 5 mg／g）0．1 g，精密稱定，共 6 份，分別置 100 mL容量瓶中，分別精密加入對照品溶液（0．222 g／L）1 mL，照供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法測定并計算回收率。見表1。

表1 甜菜堿加樣回收試驗結果（n＝6）

2．4 樣品含量測定

取3批樣品，按擬訂方法測定。結果批號為110901，110601，110602 的樣品中每份含甜菜堿 1．170 8，1．002 6，1．216 4 mg(n＝2)。

3 討論

提取方法的選擇：本試驗中考察了索氏提取、超聲和回流等提取方法，結果3種方法所得結果基本一致，而超聲提取操作簡便、快捷，故選擇超聲作為樣品提取方法。還對提取溶劑種類及濃度（甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇）和提取時間進行了考察，結果以甲醇超聲提取30 min效果最佳。

色譜柱的選擇：本試驗中曾采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱進行試驗，結果不理想，甜菜堿在C18柱上難以保留，達不到理想的分離效果。根據甜菜堿極性較大的特性，選擇HILIC柱，結果滿意。

質譜條件的選擇：本試驗中曾比較了正負2種離子模式下檢測，結果以正離子模式下檢測的靈敏度較高，故選擇正離子模式檢測。同時，因甜菜堿為小分子物質，其分子離子峰[M＋H]＋ m／z為118，在選擇離子（SIR）模式下易產生干擾，故選擇多反應監測模式，以 118．20→57．92 和 118．20→59．00 為定量離子對。

與傳統薄層掃描法比較：曾參照2010年版《中國藥典（一部）》枸杞子生品項下甜菜堿的含量測定方法測定了3批樣品中甜菜堿的含量，與試驗中建立的液相色譜－串聯質譜聯用法所測得的結果比較，含量普遍偏低。分析原因，應是傳統薄層掃描法前處理復雜、顯色困難所致。本試驗中所建立的供試品溶液處理方法簡便、快捷，不僅大大節省了人力、節約了成本，而且所測得的結果更加真實可靠，更能反映樣品中甜菜堿的真實含量。

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