頭針對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織Ang-1 mRNA的影響*

楊 敏 陳邦國 梁 超 張曉明

（湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

頭針對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織Ang-1 mRNA的影響*

楊 敏 陳邦國 梁 超 張曉明

（湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

目的觀察頭針治療對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織內血管生成素（Ang）-1 mRNA表達的影響，探討其變化規律并分析腦缺血后Ang-1在缺血性腦卒中發病中的作用機制。方法大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組和治療組，治療組又分為缺血再灌注后6、24、48、96 h組，采用改良線栓法制作永久性大腦中動脈閉塞模型，RT-PCR技術檢測各組大鼠腦組織缺血半影區內Ang-1 mRNA的表達水平。結果正常對照組、假手術組Ang-1 mRNA中等量表達，與模型組比較，頭皮針組各時間點大鼠腦組織Ang-1 mRNA含量增多，其中腦缺血再灌注48 h Ang-1 mRNA含量達高峰，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05或0.01）。結論Ang-1可能在局灶性腦缺血后與其他血管特異性生長因子共同參與缺血半影區的新血管形成，有利于缺血半影區腦組織功能恢復。

局灶性腦缺血再灌注血管生成素-1逆轉錄聚合酶鏈反應

腦缺血后，血管新生是腦微循環修復重建的重要病理生理過程。血管新生程度對卒中后神經功能恢復有非常重要的作用，而血管特異性生長因子在生產新的血管過程中起著尤為重要的作用。Ang是一族分泌型的生長因子，是一族特異性作用于血管內皮細胞的生長因子，最近的研究發現血管生成素-1（Ang-1）可以減輕腦缺血后血腦屏障的滲漏、減小梗死體積［1］。本研究通過觀察大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織Ang-1的表達，觀察頭針對血管新生的影響，進一步為頭針治療缺血性腦卒中提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組健康成年SD雄性大鼠100只（華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，清潔級），體質量（200±20）g。隨機分為正常對照組、假手術組、模型組和治療組，模型組和治療組又分為缺血再灌注后6、24、48、96 h組，每組10只。大鼠術前禁食不禁水。

1.2 模型制備大鼠大腦中動脈梗死（MCAO）模型參照Nagasawa、Zea Longa等報道的方法［2-3］并加以改進。參照Zea Longa的5級評分標準［3］對實驗動物神經功能缺損進行評分。0級為無神經功能喪失；1級為左前肢不能充分伸展；2級為向左環行運動，輕度局灶神經功能喪失；3級為向左側倒，中度局灶神經功能喪失；4級為不能自然行走，重度局灶神經功能喪失，只有神經功能障礙在1級以上的大鼠才能保留下來。假手術組大鼠暴露頸內、頸外動脈后即縫合，其余處理同手術組。正常對照組大鼠不予處理，正常給水給食。

1.3 頭針方法治療組予頭針治療，選穴依據《頭針國際標準化方案》，選取頂顳后斜線，頂顳前斜線。大鼠穴位定位根據華氏等介紹的大鼠穴位圖譜，模擬人體經穴定位［4］。頂顳后斜線為百會至曲鬢（百會穴在頂骨正中點，曲鬢穴為耳緣直上與耳尖水平線的交點）；頂顳前斜線為頂顳后斜線向前平移0.1寸。用28號1寸華佗牌不銹鋼針，與頭皮呈30°夾角透刺0.5～0.8寸，快速捻轉至針下沉澀感后，接韓氏治療儀，采用疏密波，頻率2Hz/100Hz，強度2mA，每次30min，每日1次。

1.4 標本采集與檢測治療組動物按分組情況至規定時間后，以10％水合氯醛足量麻醉，斷頭取腦，迅速在冰盤上剝離腦膜，除去嗅球、延髓和小腦，分離右側大腦皮層，仔細切取缺血灶區域大腦皮層組織塊，模型組取與治療組對應區域腦組織，放入凍存管液氮中保存。正常對照組及假手術組在缺血組對應時間點斷頭取腦，其余操作與治療組相同。采用RT-PCR檢測Ang-1 mRNA表達水平。Ang-1：F：5′-AGAGGCAGTA CATGCTAAGAATT-3′。R：5′-TCCATGGTTTTGTCCCGCAG-3′。β-actin：F：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCA CCA-3′；R：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。應用UVP計算機圖像掃描分析系統測定所檢測基因表達水平，以β-actin為內參照，計算所檢測基因的相對含量。

1.5 各組神經功能缺損程度評分參照文獻［5］制定。

1.6 統計學處理應用SPSS11.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組內各時間點間灰度值比較采用方差分析，組間相對灰度值比較采用Dunett T檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能缺損評分的比較見表1。正常對照組、假手術組與模型組、頭針組在各時相上比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；模型組動物神經缺損癥狀隨著時間延長逐漸減輕，但差異無統計學意義（P＞0.05）；頭針組與模型在各時相上的NSS比較，差異有統計學意義（P＜0.05），以腦缺血再灌注24 h時較為明顯。

表1 各組大鼠腦缺血后神經功能缺損程度評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠腦缺血后神經功能缺損程度評分比較（分，±s）

與模型組同時間點比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別n 6 h 24 h 48 h 96 h正常對照組10假手術組10模型組10 0 0 0 0 0 0 0 0 2.10±0.55 2.30±0.67 2.10±0.57 2.03±0.47治療組10 2.02±0.26 1.92±0.57**1.70±0.48**1.30±0.48**

2.2 Ang-1 mRNA的表達水平見圖1，表2。正常對照組、假手術組缺血半影區相對應區域的Ang-1mRNA呈中等水平表達，兩組相對灰度值相近（P＞0.05）；模型組中，缺血半影區內Ang-1mRNA表達水平在腦缺血再灌注后各時間點均低于治療組（P＜0.01），在腦缺血48 h，治療組Ang-1mRNA表達水平達到峰值。

圖1 RT-PCR檢測Ang-1mRNA表達水平的電泳圖

表2 各組大鼠缺血區腦組織Ang-1mRNA表達的比較（±s）

表2 各組大鼠缺血區腦組織Ang-1mRNA表達的比較（±s）

組別n 6 h 24 h 48 h 96 h正常對照組10假手術組10模型組10 0.88±0.03 0.88±0.03 0.88±0.03 0.88±0.03 0.87±0.05 0.87±0.05 0.87±0.05 0.87±0.05 0.60±0.03 0.86±0.04 1.23±0.16 0.89±0.05治療組10 0.89±0.04 1.52±0.57**1.70±0.48**1.30±0.48**

3 討論

血管生成是從已有血管發芽生成新血管的過程。這一過程與血管內皮細胞遷移和增殖相關，主要包括激活期血管基底膜降解，血管內皮細胞的激活、增殖、遷移，重建形成新的血管和血管網，是一個涉及多種細胞的多種分子的復雜過程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子協調作用的復雜過程，正常情況下二者處于平衡狀態，一旦此平衡打破就會激活血管系統，使血管生成過度或抑制血管系統使血管退化。Ang是一族分泌型的生長因子，該家族主要由Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4 4種因子組成。有研究發現其在血管內皮凋亡、血管形成后期的成熟、穩定性及重建方面扮演著非常重要的角色［6］。

頭針，又稱頭皮針，是在頭部特定的穴線進行針刺來防治疾病的一種方法，是腦源性疾病的常用針刺方法。《靈樞·大惑論》說“五臟六腑之精氣，皆上注于目而為精……而與脈并為系，上屬于腦，后出于項中”；《靈樞·邪氣臟腑病形》中說“十二經脈，三百六十五絡，其血氣皆上走空竅”；《素問·脈要精微論》說“頭者精明之

本研究表明，正常對照組、假手術組缺血半暗區Ang-1mRNA呈中等水平表達，兩組相對灰度值相近；而治療組各時間點均較模型組高，尤其是在腦缺血48 h，治療組Ang-1mRNA表達水平達到峰值。由此推斷，頭針治療可提高Ang-1的表達水平，促進與Tie-2的Fc段結合，使受體磷酸化被激活，誘導內皮細胞出芽，形成血管樹樣結構，并募集內皮周圍支持細胞，促進血管重塑和成熟，形成完整的血管壁，并通過調節內皮細胞和間質細胞的相互作用維持血管管腔的完整性和穩定性。

綜上所述，頭針通過在一定范圍內增加大鼠局灶性腦缺血再灌注后Ang-1的表達，從而促進缺血區血管新生，減輕腦缺血后的損失，達到治療缺血性卒中的目的。參考文獻

［1］Zhang ZG，Zhang L，Croll SD，et al.Angiopoietin-1 reduces cerebral blood vessel leakage and ischemic lesion volume after focal cerebralembolic ischemia inmice［J］.Neuroscience，2002，113（3）：683-687.

［2］Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood and histologic changes in a new ratmodel of cerebral artery occlusion［J］.Stroke，1989，20（8）：1037-1043.

［3］Zea Longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］華興邦.大鼠穴位圖譜的研制［J］.實驗動物與動物實驗，1991，3（1）：1-5.

［5］張曉明，董德河，丁玲.電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經行為學障礙的影響［J］.河南中醫，2012，32（5）：573-575.

［6］Ardelt AA，McCullough LD，Korach KS，etal.Estradiol regulates angiopoietin-1 mRNA expression through estrogen receptor-alpha in a rodent experimental stroke model［J］. Stroke，2005，36（2）：337-341.

［7］東貴榮，于致順，石憲.頭穴透刺治療偏癱的研究近況［J］.針灸學報，1992，9（1）：54-56.

［8］張紅星，周利，張唐法.頭針對大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷的影響［J］.浙江中西醫結合雜志，2006，16（5）：268-269.

［9］周利，張紅星，張唐法.頭針治療卒中易感型自發性高血壓大鼠的實驗研究［J］.上海針灸雜志，2006，25（6）：42-44.

［10］吳廣偉.針刺治療缺血性腦中風30例療效觀察［J］.國際醫藥衛生導報，2006，12（22）：79-80.

Expressions of Angiogenin-1 m RNA after Scalp Acupuncture in Focal Cerebral Ischem ia in Rats Brain Tissues

YANGMin，CHEN Bang-guo，Liang Chao，et al.Hubei University of Chinese Medicine，Hubei，Wuhan

430065，China

Objective:To observe the scalp acupuncture in treatment of cerebral blood vessel generation reperusion of rats with focal cerebral ischemia in the expression changes of different time points and to explore the changing rules and analysis the action mechanism of Ang-1 after cerebral ischemia in cerebral arterial thrombois.Methods:Rats were randomly divided into the normal control group，the control group，the model group and he treatment group.The treatment group was divided into the ischemia reperfusion group at 6，24，48 and 96 h，with the improved wire plug do legal permanentmiddle cerebral artery occlusion（MCAO）model.And then，some ndicators were used RT-PCR to detect each group rats ischemic penumbra area Ang-1 mRNA expression level. Results:In the normal control group，control group of Ang-1 mRNA of the equivalent expression，compared with model group，Ang-1 mRNA of the scalp needle group rats group were increased at each time point.Compared with themodel group，the cerebral ischemia reperfusion 48 h thatwas the highest concentration of these levelswas higher significantly（P＜0.05 or 0.01）.Conclusion:That Ang-1 is imoportant after focal cerebral ischemia and other vascular specific growth factor in ischemic penumbra formation of new blood vessels and inhibit apoptosis of neurons is conducive to improve the ischemic penumbra area blood supply and promote nerve functional recovery.

Focal cerebral ischemia；Reperfusion；Angiopoietin-1；RT-polymerase chain reaction

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0012-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.006

教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（200805070002）

2013-07-30）