3種常見脂多糖所致急性肺損傷大鼠模型肺損傷程度相關(guān)性研究*

申友奎 楊 勇 董禮文 王 軍 傅曉青

（浙江省杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007）

3種常見脂多糖所致急性肺損傷大鼠模型肺損傷程度相關(guān)性研究*

申友奎 楊 勇 董禮文 王 軍 傅曉青

（浙江省杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007）

目的研究3種常見脂多糖所致急性肺損傷（ALI）大鼠模型，并探討模型制作的方法和經(jīng)驗(yàn)。方法選擇130只健康SD大鼠，隨機(jī)分4組，尾靜脈注射組（40只）采用尾靜脈注射造模，氣管注入模型組（40只）采用氣管注入造模，二次打擊模型組（40只）采用“二次打擊”方式造模，另選10只SD大鼠為對(duì)照組。結(jié)果完成實(shí)驗(yàn)后，尾靜脈注射組死亡4只，氣管注入模型組死亡10只，二次打擊模型組死亡12只，尾靜脈注射組與氣管注入模型組、二次打擊模型死亡率組比較具有明顯差異。肺組織干濕質(zhì)量比3組之間無顯著性差異；病理學(xué)顯示氣管注入模型組病理損傷不均勻，以氣道上皮的水腫、壞死脫落，氣道內(nèi)以中性粒細(xì)胞為主的多種炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特點(diǎn)。尾靜脈注射組及二次打擊模型組病理損傷多較均勻，以毛細(xì)血管滲透性增高，纖維蛋白滲出，肺水腫形成為主要特點(diǎn)。尾靜脈注射組較氣管注入模型組量化值稍高，但未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尾靜脈注射組、氣管注入模型組與二次打擊模型組量化值比較，量化值增高明顯，具有顯著差異（P＜0.05或0.01）。結(jié)論3種方式均能成功制造急性肺損傷模型，但尾靜脈注射組死亡率低，操作簡(jiǎn)便且病理學(xué)較為符合人類ALI病理學(xué)改變，且穩(wěn)定可靠。

急性肺損傷脂多糖模型

急性肺損傷（ALI）的相關(guān)性研究已經(jīng)持續(xù)了很多年，然而其死亡率仍然居高不下，建立完善的動(dòng)物模型是闡明其發(fā)病機(jī)制的前提和重要保證。理想的ALI模型應(yīng)可模擬人類ALI發(fā)病機(jī)制和發(fā)生、發(fā)展過程，但目前尚無一種動(dòng)物模型能完全模擬人類ALI病變特征。筆者采用目前常用的3種脂多糖所致ALI大鼠模型進(jìn)行比較，為下一步研究提供切實(shí)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物脂多糖（LPS）產(chǎn)自Sigma公司，批號(hào)為0111：B4。

1.2 動(dòng)物健康SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量250～300g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 分組與造模將120只SD大鼠隨機(jī)分為尾靜脈注射組、氣管注入模型組、二次打擊模型組、每組40只。再選擇10只SD大鼠作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。（1）尾靜脈注射組。尾靜脈注射LPS，劑量為4mg/kg，4 h后，觀察大鼠死亡率、呼吸頻率，處死大鼠，摘取肺組織，用于病理學(xué)檢查機(jī)測(cè)定含水量。（2）氣管注入模型組。應(yīng)用水合氯醛30mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定于鼠板上，消毒后逐層分離暴露氣管，沿氣管切T型切口插Y型管，建立外部呼吸通道，并用注射器分別經(jīng)支氣管緩慢滴注事先用生理鹽水配制的LPS（2mg/mL）溶液，待大鼠呼吸狀態(tài)穩(wěn)定后，縫合傷口后放回鼠籠。8 h后，觀察大鼠死亡率、呼吸頻率，處死大鼠采取肺組織，用于病理學(xué)檢查及含水量測(cè)定。（3）二次打擊模型組。應(yīng)用水合氯醛30mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定于鼠板上，在大鼠腹腔注射麻醉后鉗夾雙側(cè)股骨中段閉合骨折，2 h后腹腔注射LPS（16mg/kg）。24 h后，觀察大鼠死亡率、呼吸頻率，處死大鼠采集肺組織，用于病理學(xué)檢查及含水量測(cè)定。

1.4 肺組織含水量測(cè)定取部分左肺，濾紙吸干表面水分，置于干燥稱量紙上稱得濕質(zhì)量（W），置70℃恒溫箱，烘烤至恒重后稱量干質(zhì)量（D），以濕質(zhì)量/干質(zhì)量（W/D）比值表示肺組織含水量。

1.5 肺臟組織學(xué)觀察取剩余左肺放入10％甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、包埋、蘇木素伊紅（HE）染色后光鏡下觀察肺組織病理改變。將肺組織學(xué)改變程度分為“無”、“輕”、“中”和“重”4級(jí)進(jìn)行比較，并量化成計(jì)量單位。比較內(nèi)容包括毛細(xì)血管充血、肺泡腔纖維蛋白滲出、肺泡腔及其間隔中性粒細(xì)胞滲出、氣道黏膜上皮細(xì)胞脫落、肺泡間隔增寬，見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組之間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡率、呼吸頻率比較（1）死亡率比較：尾靜脈注射組死亡4只，均在3 h后死亡，死亡率10.00％，氣管注入模型組死亡10只，1 h內(nèi)死亡5只，2 h內(nèi)死亡3只，6～8 h死亡2只，死亡率25.00％，二次打擊模型組死亡12只，1 h內(nèi)死亡2只，4～8 h死亡2只，8～10 h死亡8只，死亡率30.00％。（2）呼吸頻率比較：見表2。

表1 肺組織學(xué)觀察程度

2.2 肺組織含水量測(cè)定見表2。

表2 各組呼吸頻率及肺組織含水量比較（±s）

表2 各組呼吸頻率及肺組織含水量比較（±s）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別n呼吸頻率（次/min）W/D尾靜脈注射組36 108.44±9.58△4.32±0.21△氣管注入模型組30 110.53±7.10△4.33±0.20△二次打擊模型組28 104.25±4.18△4.27±0.16△對(duì)照組10 71.50±5.00△3.99±0.21

2.3 病理學(xué)觀察從病理照片（圖1）可以看出對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)明顯，毛細(xì)血管充血，肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡間隔無水腫，3個(gè)模型組均有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，透明帶與肺泡結(jié)構(gòu)破壞，毛細(xì)血管充血，上皮細(xì)胞脫落。但氣管注入模型組病理損傷不均勻，氣道上皮的水腫、壞死脫落，氣道內(nèi)以中性粒細(xì)胞為主的多種炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特點(diǎn)。尾靜脈注射組及二次打擊模型組病理損傷多較均勻，以毛細(xì)血管滲透性增高、纖維蛋白滲出、肺水腫形成為主要特點(diǎn)。從表3可以看出尾靜脈注射組較氣管注入模型組量化值稍高，但未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尾靜脈注射組與二次打擊模型組具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），氣管注入模型組與二次打擊模型組比較，量化值增高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)改變（HE，200倍）

表3 肺組織學(xué)改變程度量化值（±s）

表3 肺組織學(xué)改變程度量化值（±s）

組別n病理學(xué)量化值尾靜脈注射組36 11.89±1.97氣管注入模型組30 11.63±2.06二次打擊模型組28 10.61±2.00*△與尾靜脈注射組比較，*P＜0.01；與氣管注入模型組比較，△P＜0.05。

3 討論

通過實(shí)驗(yàn)研究，誘導(dǎo)建立可靠理想的ALI模型，是對(duì)人類ALI的發(fā)病機(jī)制和診療策略的研究的重要保障。目前建立此模型的方法主要有3種［1］：（1）物理方法，主要以創(chuàng)傷為主；（2）化學(xué)方法，油酸、脂肪型、整肺灌洗型、白枯草型等；（3）生物方法，內(nèi)毒素型、休克復(fù)合內(nèi)毒素型、急性胰腺炎型、腫瘤壞死因子型等。其中內(nèi)毒素致ALI模型是急性肺損傷模型中較為經(jīng)典成熟的模型。尾靜脈注射、二次打擊及支氣管滴注是目前內(nèi)毒素復(fù)制大鼠ALI模型的常用的給藥途徑。

本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3種常用的給藥途徑誘導(dǎo)急性肺損傷的造模方式，3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的呼吸頻率均有明顯增快，與人類ALI的臨床較為吻合。尾靜脈注射組死亡率較低，死亡發(fā)生在造模晚期，氣管注入組死亡率較高，且死亡多出現(xiàn)在造模早期，可能與操作復(fù)雜、藥物濃度高，且打擊較為直接有關(guān)。二次打擊死亡率較高，死亡多出現(xiàn)在造模晚期，可能與第一次打擊激發(fā)引起機(jī)體全身炎癥反應(yīng)綜合征，此時(shí)由于大量炎性因子的釋放和機(jī)體免疫功能降低，使機(jī)體敏感性增高，在此基礎(chǔ)上第二次打擊造成炎癥失控引起實(shí)驗(yàn)大鼠死亡有關(guān)。

病理觀察結(jié)果顯示，3組均有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、透明帶與肺泡結(jié)構(gòu)破壞、毛細(xì)血管充血、上皮細(xì)胞脫落；氣管注入組病理的表現(xiàn)病理損傷不均勻，且氣道上皮的水腫、壞死脫落，氣道內(nèi)以中性粒細(xì)胞為主的多種炎細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯，造成的原因可能與造模過程中氣管內(nèi)注入的LPS分布不均相關(guān)。尾靜脈注射組及二次打擊組病理損傷多較均勻，以毛細(xì)血管滲透性增高、纖維蛋白滲出、肺水腫形成為主要特點(diǎn)，可能與LPS先進(jìn)入血液循環(huán)，再導(dǎo)致全身性膿毒血癥有關(guān)的［2］。

從3種操作方式而言，尾靜脈注射組最為簡(jiǎn)便，二次打擊組操作較復(fù)雜，支氣管注入組操作更為復(fù)雜，且對(duì)實(shí)驗(yàn)者的要求比較嚴(yán)格。總之，3種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途艹晒?fù)制ALI模型，可用來研究ALI的發(fā)生、發(fā)展過程及相關(guān)的問題的研究，是良好有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，但尾靜脈注射組死亡率低、操作簡(jiǎn)便且病理學(xué)較為符合人類ALI病理學(xué)改變。

［1］李竹英，王雪慧，劉建秋.急性肺損傷動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2011，20（11）：817-1818.

［2］朱耀斌，李曉鋒，張燕搏，等.急性肺損傷動(dòng)物模型［J］.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2011，25（7）：625-628.

Correlation Study of 3 Acute Lung Injury Rats Models induced by Lipopolysaccharides

SHEN You-kui，

YANG Yong，DONG Li-wen，et al.TCMHospital of Hangzhou City，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 310007，China

Objective:To study 3 widely used rats models of acute lung injury by lipopolysaccharides and to discuss the modelmaking methods and experiences.Methods:130 healthy SD rats were divided into 4 groups random ly including the tail vein injection group with 40 rats，the trachea injection group with 40 rats，the secondary blow mold group with 40 rats and the control group with 10 rats.Results:After being finished the experiment.There were some rats died such as 4 rats in the tail vein injection group，10 rats in the trachea injection group，12 rats in the secondary blow mold group.Compared with the trachea injection group and the secondary blow mold，the tail vein injection group had significant differences in themortality.There were no significant differences among 3 groups in wet and dry lung tissuemass ratio.3 groups of pathology showed that the trachea injection group pathological damage was uneven.Meanwhile，the airway epithelial edema and the necrosis felloff. The airway predominantly neutrophils were a variety of inflammatory cell infiltration as the main characteristics. The tail vein injection group and the secondary blowmold group pathological damage weremore uniform，capillary permeability increase，fibrin exudation and edema formation as the main characteristics.quantitative value of pathological in tail vein injection group was a bit higher than that in the trachea injection group.However，there were no significant differences among these indicators.The tail vein injection group and the trachea injection group compared with the secondary blow mold group quantitative values of pathological increased obviously，there was the extremely significant difference in them.Conclusion:3 methods can successfully manufacture model of acute lung injury.Themortality rate is low，easy to operate and pathologicalmore accord with human ALI pathological change in the tail vein injection group.Themodel is stable and reliable.It is the further study basis of acute lung injury occurrence，development process and related problems.

Acute lung injury；Lipopolysaccharide；Model

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2111294）

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0019-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.009

2013-09-12）

·病例報(bào)告·