冠脈結扎法建立大鼠急性心肌梗死模型方法的探討*

張 凱 謝世陽 王幼平 劉衛紅 李 彬 朱明軍△

（1.河南中醫學院第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫學院，河南 鄭州 450008）

·研究報告·

冠脈結扎法建立大鼠急性心肌梗死模型方法的探討*

張 凱1，2謝世陽1王幼平1劉衛紅1李 彬1朱明軍1△

（1.河南中醫學院第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫學院，河南 鄭州 450008）

目的建立一種方便、省時、死亡率低且穩定的急性心肌梗死模型制作方法。方法雄性成年Sprague· Dawley大鼠麻醉后在呼吸機支持下，于相應第3、4脅間隙處開胸，擠壓兩側胸壁，將心臟擠出于胸腔外，通過結扎左冠狀動脈前降支，建立心肌梗死模型。通過觀察術后大鼠心電圖的變化，以及分別利用Evan blue染色及病理組織學方法于術后3 h及1周，確定心肌缺血及梗死范圍，同時觀察術中、術后24 h及1周大鼠的存活率。結果術后大鼠Ⅰ、Ⅱ導聯心電圖ST段明顯抬高。術后3 h大鼠心臟Evan blue染色顯示心肌缺血區恒定。術后1周處死取出大鼠心臟，可見心臟前壁、側壁及心尖處形成境界清晰的心肌梗死區，梗死區顏色明顯淺于周圍的心肌，呈蒼白色，失去正常光澤。術后1周大鼠心肌組織HE染色，可見梗死區伴有大量炎性細胞浸潤。造模成功率為83％，術后24 h存活率為77％，術后1周大鼠總存活率為72％。結論此模型操作簡單、穩定，且術后動物存活率高，是研究心肌梗死較理想的模型。

大鼠 心肌梗死 冠狀動脈 結扎 造模

冠心病是危害人類健康的常見心血管疾病之一。冠心病心肌梗死因發病急、病死率高而對人類的危害甚大。在針對心肌梗死的基礎研究中，動物模型的建立是進行該研究的基本保障。目前采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死動物模型是最常用的一種方法［1］，其與臨床心肌梗死的病理生理過程非常相似［2］。通過查閱國內外大量文獻，筆者發現采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型在結扎方法上多集中于開胸后胸腔內結扎和開胸擠出心臟體外結扎兩種，對于這兩種方法的大鼠成活率、模型穩定性報道不一［3-4］。筆者通過實驗發現，以存活率、穩定性和造模時間等幾方面考慮，采用開胸擠出心臟體外結扎大鼠左冠狀動脈前降支制作大鼠急性心肌梗死模型的方法值得推薦。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠 60只，體質量（220±30）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要儀器及試劑 小型動物呼吸機（美國Havard Model 680型），心電圖機（澳大利亞埃德公司ML870Br型），外科剪刀、止血鉗、小鑷子、醫用縫合針等手術器械，伊文氏藍（美國Sigma公司），水合氯醛（天津福晨化學試劑廠）超純水配制成10％溶液，慶大霉素針（武漢遠大制藥集團股份有限公司）。

1.3 大鼠造模前準備 術前禁食12 h；大鼠稱質量，用10％水合氯醛腹腔內注射麻醉（0.1 mL/100 g），大鼠胸部手術區備皮及皮膚常規消毒。

1.4 胸腔外結扎左冠狀動脈造模 見圖1。經腹腔麻醉后，將大鼠固定在手術臺板上，連接心電圖，并使用燈光照射保暖。用橡皮筋掛住大鼠門牙，使大鼠頭向后仰，將氣管插管插入大鼠氣管，插管后膠布固定，連接呼吸機，呼吸機頻率為60次/min，潮氣量3 mL/100 g。于大鼠心尖搏動最強點的上一肋間，相應于第3、4脅間間隙處為切口位置，橫向剪開皮膚，首先沿切口穿線以備術末做荷包縫合。隨后用止血鉗鈍性分離皮下組織及肌層，分離肋間肌，注意沿肌肉紋理分離，并深入穿破胸膜，擠壓兩側胸壁，把心臟擠出胸腔。將心尖向上推起固定，在肺動脈圓錐和左心耳下緣約1 mm處，用醫用縫合線連同一束心肌結扎左冠狀動脈前降支，結扎完成后迅速將心臟復位，當見結扎線以下心肌顏色改變同時伴隨心臟博動減弱，體表心電圖出現明顯ST段抬高后，說明結扎冠脈成功，隨后擠出胸腔內氣體，拉緊荷包縫合。待大鼠恢復自主呼吸，狀態平穩后，停用呼吸機，拔除氣管內插管，造模結束。

圖1 大鼠胸腔外結扎左冠狀動脈造模過程

1.5 術后一般處理和觀察 術后將大鼠置于電熱毯上保溫，予術后抗感染治療：慶大霉素（2 mL∶8萬U）腹腔注射，每日1次，每次0.2 mL，連續給藥3 d。觀察大鼠術中、術后24 h及1周大鼠存活率。

1.6 大鼠心肌缺血范圍觀察 大鼠心肌梗死模型建立成功，術后3 h處死大鼠，立即經頸動脈插管注入l％伊文氏藍2 mL，觀察大鼠心臟染色情況；大鼠心梗模型建立成功后，喂養1周，處死大鼠，開胸取出心臟，肉眼觀察大鼠心臟形態改變。

1.7 大鼠心臟組織形態學觀察 大鼠心梗模型建立成功后，喂養1周，處死大鼠，開胸取出心臟，于冰生理鹽水中洗去血液，用10％甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋切片，行HE染色后，鏡下觀察大鼠梗死區心肌組織形態變化。

2 結果

2.1 大鼠冠脈結扎前、后心電圖的變化 見圖2。動態觀察手術前、后Ⅰ、Ⅱ導聯心電圖的改變。可見術后Ⅰ、Ⅱ導聯ST段均出現了明顯的抬高。

圖2 大鼠冠脈結扎前、后心電圖的變化

2.2 術中及術后大鼠存活率 在本實驗中，所有手術均在5～10 min內完成，60只SD大鼠，術中死亡10只，造模成功率為83％，術后24 h內死亡4只，術后24 h存活率為77％，至術后1周實驗終點，共成活43只，術后1周總存活率為72％。

2.3 大鼠心肌缺血及梗死范圍觀察 見圖3。術后3 h大鼠心臟經伊文氏藍染色可見，紅色為缺血心肌，藍色為正常心肌。術后1周大鼠心臟，可見心臟前壁、側壁及心尖處形成境界清晰的心肌梗死區，梗死區顏色明顯淺于周圍的心肌，呈蒼白色，失去正常光澤。

圖3 大鼠心肌缺血及梗死范圍觀察

2.4 術后1周心肌形態觀察 見圖4。心梗術后1周，大鼠心肌組織HE染色顯示，梗死區伴有大量炎性細胞浸潤。

圖4 術后1周心肌形態觀察

3 討論

目前，使用大鼠建立心肌梗死模型的方法趨于成熟，現在國內外已普遍使用。傳統的胸腔內結扎左冠狀動脈造模方法，由于實驗操作的過程復雜、耗時、創傷大，且出血多，因而導致大鼠恢復較慢，極易造成死亡，成功率低。然而，胸腔外擠出心臟結扎左冠狀動脈造模方法，省時且對大鼠機體損害小，故明顯減少了大鼠的死亡率，提高了造模成功率。有關文獻報道大鼠心肌梗死造模術后24 h存活率為40％～60％［5-6］，本方法造模成功率為83％，術后24 h存活率為77％。

麻醉是動物實驗必不可少的步驟，麻醉也是關系到造模成功與否的重要因素。對大鼠的麻醉大多采用吸入麻醉和藥物注射麻醉。吸入麻醉常用的有乙醚［7］、藥物注射麻醉常用的有氯胺酮、戊巴比妥鈉［8］、水合氯醛［9］，而藥物注射麻醉常為制作心肌梗死模型的主要方法［10］。筆者在早期實驗研究過程中使用3％戊巴比妥鈉（1.0 mL/kg）麻醉大鼠，發現戊巴比妥鈉麻醉后，大鼠復蘇時間相對較長，自主呼吸恢復較慢，并且麻醉后易致大鼠呼吸道分泌物明顯增多，如不及時清理，大鼠很容易發生窒息。采用10％水合氯醛麻醉后大鼠呼吸道分泌物較戊巴比妥鈉麻醉大鼠少、起效快，對動物呼吸頻率、體溫及心率的影響小，顯著降低了大鼠術中的死亡率。

術中及術后注意給予大鼠保溫。由于大鼠術中受到較大的手術創傷，機體處于應激狀態，大鼠在術中及術后時常伴發低體溫，對大鼠機體的生理功能有很大影響，增加了死亡率，因此在術中對大鼠進行燈光照射保暖，特別對術中出血的大鼠尤為重要。術后的保溫，不但縮短了大鼠的蘇醒時間，而且明顯提高了存活率。王小慶等報道，將麻醉后6 h內的大鼠置于20℃以下室溫的環境中可明顯增加動物的死亡率，尤其對麻醉尚未蘇醒的動物。因此良好的術中、術后處理可以提高動物模型的生存率［11］。

擠出心臟于胸腔外結扎左冠狀動脈的造模方法使建立大鼠心肌梗死模型時間明顯減少。在本實驗中，所有手術均在5～10 min內完成，不僅提高了工作效率，而且由于結扎時間縮短還可減少心律失常的發生，從而減少了術中大鼠死亡。Garikipati Venkata NS等［12］報道，大鼠心肌梗死模型手術過程需要20 min。

在擠出心臟于胸腔外結扎左冠狀動脈造模過程中，以止血鉗鈍性分離肋間肌進胸，不需剪斷肋骨，能較好地保持胸部正常解剖結構，不僅有利于自主呼吸的恢復，還由于心臟被擠出能充分暴露手術視野，便于固定，減少了心臟跳動對結扎的影響，提高了冠脈結扎的準確性，減少了由于心臟和大血管受到牽拉而發生的急性心律失常，降低了造模死亡率。然而，在胸內結扎左冠狀動脈造模過程中需要剪斷肋骨，剪斷的肋骨容易造成進一步的肺損傷，以及在開胸及結扎冠脈時需拉開肺組織，稍有不慎，手術器械就有可能損傷肺組織，從而影響術后呼吸功能。另外，由于大鼠無縱隔結構，開胸也易造成開放型氣胸。

結扎大鼠左冠狀動脈造模手術，由于涉及大鼠心、肺臟器，一旦發生感染將增加模型的死亡率。然而，擠出心臟于胸腔外結扎左冠狀動脈造模方法，由于手術傷口小，可大幅度減少大鼠感染機會。

總之，筆者在綜合以往建立大鼠心肌梗死模型方法的基礎上，對麻醉方法、手術方式及術后處理進行改進，建立了一種較理想的大鼠心肌梗死動物模型。本方法操作簡單、省時、術后存活率高、模型穩定，可用于心肌梗死的發病機制、藥物治療等方面的研究。

［1］Supinski GS，Callahan LA.Diaphragmatic free radical Generation increases in an animal model of heart failure［J］.J Appl Physiol，2005，99（3）：1078-1084.

［2］卓莉莎，高云華，徐亞麗，等.大鼠心肌梗死模型的建立與評價［J］.臨床超聲醫學雜志，2009，11（9）：577-580.

［3］陳會強，崔煒，方敬，等.大鼠急性心肌梗死模型制作方法的改進［J］.河北醫科大學學報，2011，32（11）：1351-1352.

［4］李貽奎，趙樂，和萍，等.提高結扎冠狀動脈在體大鼠心肌梗死模型制作速度和質量的實驗研究［J］.中國中西醫結合雜志，2012，32（7）：948-950.

［5］Michael H，Helga R，Hinrik S，et al.Chronic phosphocreatine depletion by the creatine analogue β-Guanidinopropionate is associated with increased mortality and loss of ATP in Rats after Myocardial Infarction［J］.Circulation，2001，104（6）：1844-1849.

［6］Li MH，Zheng C，Takayuki S，et al.Vagal nerve stimulation markedly improvesLong-term survival after chronic heart failure in rats［J］.Circulation，2004，109（15）：120-124.

［7］陳業農，周逸平，汪克明，等.急性心肌缺血再灌注損傷大鼠模型制備方法的改進與評價［J］.中國中醫急癥，2008，17（3）：359-363.

［8］周文武，林玲，陳軍，等.冠脈結扎法制做大鼠心肌缺血模型［J］.中國實驗動物學報，2004，12（4）：226-230.

［9］謝勇，劉柏炎，蔡光先.心寧片對心肌梗死后大鼠心肌自由基的影響［J］.中國中醫急癥，2009，18（11）：1841-1861.

［10］劉開字，田海，孫露，等.標準化大鼠心肌梗死模型的制作［J］.哈爾濱醫科大學學報，2007，41（6）：531-534.

［11］王小慶，胡承恒，伍貴富，等.降低大鼠心肌梗死模型死亡率的方法［J］.嶺南心血管病雜志，2007，13（2）：141-144.

［12］Garikipati Venkata NS，Prem P，Naresh KT，et al.Establishment of a rat model of myocardial infarction with a high survival rate：A suitable model for evaluation of efficacy of stem celltherapy［J］.Journal ofStemCells＆RegenerativeMedicine，2009，15（1）：30-36.

Evaluation of Rat Model of Myocardial Infarction Induced by Ligation of Coron-ary Artery

ZHANG Kai，XIE Shiyang，WANG Youping，et al. First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Henan，Zhengzhou 450000，China

Objective：To build a rat model of acute myocardial infarction characterized by convenience，timesaving，stabilization，and low mortality.Methods：After male adult Sprague-Dawley rats were anesthetized and ventilated，left-sided thoracotomy was performed between the third and fourth intercostal spaces.The left anterior descending coronary artery was ligated following the heart was rapidly exteriorized.The ligation of LAD was verified by the use of electrocardiogram（ECG）.We evaluated myocardial infarction using Evan blue staining and histological studies 3 hours and 1 week after myocardial infarction.The survival rate was determined during the period of surgery，24 hours and 1 week after myocardial infarction.Results：ECG showed that the S-T segment elevation was seen in lead I and II immediately after ligation of LAD.Evan blue staining demonstrated that the ischemic area was consistent 3 hours after myocardial infarction.The infarcted myocardium was found to be thick and pale 1 week after myocardial infarction.The infarcted myocardium with inflammatory cell infiltration was shown in HE staining.The survival rate was 83％，77％，and 72％during the period of surgery，24 hours，and 1 week after myocardial infarction，respectively.Conclusions：This model with the characterization of simplicity，stabilization，and low mortality may be suitable for studying myocardial infarction.

Rat；Myocardial infarction；Coronary artery；Ligation；Molding

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1397-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.001

2014-05-04）

國家自然科學基金項目（81173410）；國家自然科學基金項目（81373853）；河南省高校科技創新團隊支持計劃（13IRTSTHN012）

△通信作者