人參皂苷Rh2通過GATA-1誘導K562細胞紅系分化作用的研究*

武 劍 王 煒 李 曉

（浙江省杭州市第一人民醫院，浙江 杭州 310006）

人參皂苷Rh2通過GATA-1誘導K562細胞紅系分化作用的研究*

武 劍 王 煒 李 曉

（浙江省杭州市第一人民醫院，浙江 杭州 310006）

目的了解人參皂苷Rh2是否通過GATA-1蛋白誘導白血病細胞株K562的分化作用。方法利用凝膠集落生成實驗檢測不同濃度人參皂苷Rh2對白血病細胞株K562的增殖抑制作用；采用免疫細胞化學法和Western-blot法檢測不同濃度人參皂苷Rh2處理前后K562細胞株中GATA-1蛋白表達情況。結果凝膠集落生成實驗結果顯示人參皂苷Rh2對K562細胞有明顯的增殖抑制作用，且呈劑量依賴性；免疫細胞化學法和Western-blot法提示人參皂苷Rh2可誘導K562細胞內GATA-1表達，且呈劑量依賴性。結論人參皂苷Rh2可顯著抑制白血病細胞株K562的生長，其作用呈濃度依賴性；人參皂苷Rh2在體外可通過上調GATA-1蛋白表達誘導K562向紅系細胞方向分化。

人參皂苷Rh2 白血病 分化 GATA-1

研究認為人參皂苷Rh2可提升人體免疫力，刺激正常人紅系和粒系祖細胞分化而促進血細胞生成［1］，但目前關于其機制的研究尚不十分明確。本課題旨在通過各種檢測方法，在體外觀察人參皂苷Rh2對白血病細胞株K562的紅系分化作用并初探其機制，從而為人參皂苷Rh2臨床使用提供更有利證據，也為白血病治療尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 K562細胞由本實驗室保存，IMDM培養基購自美國Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青公司，GATA-1抗體、二抗購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體購自武漢博士德公司，人參皂苷Rh2購自浙江亞克藥業有限公司。

1.2 細胞培養 將K562細胞常規培養于含15％小牛血清的IMDM培養基中，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 集落生成實驗 計數細胞濃度為5×103/mL，分為10、20、40和80 mg/L 4個濃度為實驗組，并以不加藥為對照組，共5組分別進行細胞集落培養，做3個重復孔并重復3遍。于37℃、5％CO2的恒溫箱中培養7 d后，以大于40個細胞的聚合為一個集落，觀察計數每孔的集落數，并計算抑制率/％=（A對照組－A實驗組）/A對照組×100％。

1.4 細胞免疫化學 5組細胞于恒溫箱中培養7 d后，收集細胞并調整濃度為1×106/mL取100 μL，800 rpm離心5 min甩片。4％多聚甲醛固定15 min，PBS清洗標本3次，0.5％Triton X-100（DPBS配）孵育20 min，PBS清洗標本3次。GATA-1一抗孵育4℃過夜，用PBS液清洗標本3次，二抗37℃孵育30 min，PBS清洗標本3次各5min，DAB顯色，蒸餾水洗2次，蘇木素復染1min，自來水洗30 min，中性樹膠封片。

1.5 Western-blot法檢測K562細胞內GATA-1蛋白表達量 5組細胞于恒溫箱中培養7d后，收集細胞并分別提取蛋白，Western-blot法檢測各組GATA-1蛋白表達情況，以β-actin為內參。

1.6 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rh2對K562細胞半固體集落生成的影響 見表1。使用不同劑量人參皂苷Rh2處理K562細胞7 d后，隨著劑量的增加，人參皂苷Rh2對細胞增殖的抑制率升高，呈一定的劑量依賴關系。

表1 人參皂苷Rh2對K562細胞集落生成的抑制（n＝9，±s）

表1 人參皂苷Rh2對K562細胞集落生成的抑制（n＝9，±s）

與對照組比較，△P＜0.05。

組 別 人參皂苷Rh2（mg/L）集落數/103個細胞 抑制率（％）對照組 0141.0±4.3 0實驗組1 10127.1±4.6△ 9.8±3.3△實驗組2 20112.8±4.0△ 20.0±3.5△實驗組3 4071.9±4.8△ 48.9±4.2△實驗組4 8052.3±4.2△ 62.9±3.2△

2.2 人參皂苷Rh2對K562細胞中GATA-1蛋白表達的影響 見圖1，圖2。不同濃度人參皂苷Rh2處理K562細胞7d后，隨著劑量的增加，細胞免疫化學及Western-blot法檢測均顯示人參皂苷 Rh2可誘導K562細胞GATA-1蛋白表達的增高，且呈一定劑量依賴性。

3 討論

中醫學認為白血病是由于“邪毒”侵入營血，攻注骨髓、肝、腎，從而使陰陽失衡，骨髓造血功能障礙而發病［2］。中醫對白血病的治療主要是調理陰陽，使肝、脾、腎等器官功能得到恢復，同時可促進幼稚細胞凋亡、誘導其分化等作用，使骨髓造血功能重新啟動，以達到陰陽平衡，使白血病患者達到康復。人參作為抗衰老、強壯劑和補氣血藥物已有千余年的應用歷史，有關人參皂苷可以調節腫瘤細胞的生長代謝，促進腫瘤細胞分化，誘導細胞凋亡的研究已成為近年來國內外研究的熱點［3-4］。

人白血病細胞株K562是急性髓系白血病細胞，在誘導因素作用下可向多系分化，它與人多向造血祖細胞的生物學特點相似，是研究細胞分化的理想模型。本實驗以K562細胞株為研究對象，觀察人參皂苷Rh2對K562細胞的增殖抑制及誘導分化作用，并初步探索其機制。結果顯示人參皂苷Rh2對K562細胞的增殖抑制作用具有劑量依賴性，隨著劑量的增加，抑制作用增強。在誘導紅系分化方面，添加不同劑量的人參皂苷Rh2可明顯提高K562細胞紅系特異性核轉錄因子GATA-1蛋白的表達，提示人參皂苷Rh2可能具有誘導紅系分化的作用，從而為人參皂苷Rh2今后的臨床應用提供理論基礎。

圖1 細胞免疫化學法檢測人參皂苷Rh2對K562細胞中GATA-1蛋白表達的作用（×1000）

圖2 蛋白免疫印跡法檢測人參皂苷Rh2對K562細胞中GATA-1表達

［1］姚云，陳雪松，趙英佒，等.人參皂苷Rh2調節白血病細胞增殖分化的作用［J］.解剖學雜志，2011，34（4）：469-472.

［2］何南，姚晶，潘小濤，等.白血病的中藥治療［J］.吉林醫藥學院學報，2011，32（3）：171-173.

［3］黃莉，黃純蘭.威靈仙總皂苷誘導急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4分化作用的研究［J］.中國中醫急癥，2012，21（8）：1248-1250.

［4］Yi JS，Choo HJ，Cho BR，et al.Ginsenoside Rh2 induces ligand-independent Fas activation via lipid raft disruption［J］. Biochem Biophy Res Comm，2009，385（2）：154-159.

Effect of Ginsenoside Rh2 on Inducing Erythroid Differentiation of K562 Cells through GATA-1

WU Jian，WANG Wei，LI Xiao.Hangzhou First People's Hospital，Zhejiang，Hangzhou 310006，China

Objective：To investigate whether the ginsenoside Rh2 could induce the differentiation of K562 cells through GATA-1.Methods：K562 cells were treated with different concentrations of ginsenoside Rh2.Gel colony forming experiment was used to detect the proliferation.Immunocytochemical and Western-blot were used to detect the expression of GATA-1 in K562 cells.Results：Ginsenoside Rh2 could significantly inhibit proliferation and enhance expression of GATA-1 in K562.Conclusion：Ginsenoside Rh2 can significantly inhibit the growth of K562 and induce its erythroid differentiations.

Ginsenoside Rh2；Leukemia；Differentiation；GATA-1

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1451-02

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.021

2014-04-23）

浙江省杭州市醫藥衛生計劃項目（2012B005）