復方清熱顆粒對多重耐藥陰溝腸桿菌主動外排泵影響的藥敏試驗*

陳玉嬌 任愛民 王 紅 張淑文

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京 100050）

復方清熱顆粒對多重耐藥陰溝腸桿菌主動外排泵影響的藥敏試驗*

陳玉嬌 任愛民 王 紅 張淑文

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京 100050）

目的觀察中藥復方清熱顆粒對多重耐藥陰溝腸桿菌（Ecl）主動外排泵機制的影響。方法（1）含藥血清的制備：選購健康大耳白兔，隨機分為兩組，試驗組6只和空白對照組6只，適應性喂養1周。實驗組予以無菌復方清熱顆粒劑藥液灌胃，每日2次，連續給藥5 d；對照組予同等體積滅菌蒸餾水灌胃相同時間及給藥次數。末次給藥后60 min，無菌心臟采血，分離含藥血清和空白血清，于-20℃保存備用。（2）應用外排泵抑制劑碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）篩選出外排泵表型陽性多重耐藥Ecl 10株，利用瓊脂對倍稀釋法測出環丙沙星，對上述Ecl的最小抑菌濃度（MIC）值，并用同樣方法測出含藥血清、空白血清、復方清熱顆粒、CCCP及分別聯合環丙沙星對上述10株Ecl的最小抑菌濃度（MIC）值變化。結果復方中藥清熱顆粒含藥血清可降低環丙沙星對多重耐藥EclMIC值。結論中藥復方清熱顆可抑制多重耐藥Ecl的耐藥情況。

陰溝腸桿菌 主動外排泵 復方清熱顆粒

陰溝腸桿菌（Ecl）是一種重要的臨床條件致病菌，其所致感染約占腸桿菌屬感染的65％～75％［1］，主要引起菌血癥，呼吸道、泌尿道等感染。近年，由于長期和不合理廣譜抗生素的使用，多重耐藥（MDR）Ecl的出現越來越普遍［2］，導致ICU感染病死率增加，給臨床治療帶來了極大困難［3］。本院中藥復方清熱顆粒由蒲公英、敗醬草、虎杖、半枝蓮組成，具有清熱解毒和瀉下等功效。多項研究表明復方清熱顆粒具有抗菌活性，可以改善耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等的耐藥性［4-5］。本實驗在前期研究基礎上，繼續探討復方清熱顆粒能否改善多重耐藥Ecl的耐藥情況。

1 材料與方法

1.1 動物 健康大耳白兔12只，體質量1.8～2.5 kg，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，實驗前均適應性喂養1周。

1.2 菌株 實驗組菌株為2009年至2013年北京友誼醫院微生物室菌庫保存的臨床分離多重耐藥Ecl菌株，均對青霉素類、氨基糖苷類及喹諾酮類抗生素耐藥，共13株；標準質控菌株大腸埃希菌ATCC25922，EclATCC13047，為友誼醫院檢驗中心微生物室保存菌株。

1.3 藥物 環丙沙星（CIP）：購自中國食品藥品檢定研究院，批號13045-201203，用無菌去離子水配成濃度為2.56 mg/mL的儲備母液，過濾除菌，于-20℃保存備用；中藥復方清熱顆粒劑（蒲公英、敗醬草、黃芪、半枝蓮等）：由北京康仁堂藥業有限公司按指定藥方比例加工合成。

1.4 試劑與設備 碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）：美國Sigma公司，C2759-100MG；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），北京索來寶科技有限公司，200-664-3；血瓊脂培養基，生物梅里埃（法國）公司；MH瓊脂粉，批號1136737，OXOID有限公司。VITEK全自動微生物分析系統，生物梅里埃（法國）公司；光電比濁儀，生物梅里埃（法國）公司；電熱恒溫培養箱DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.5 血清制備 （1）復方清熱顆粒含藥血清的制備：隨機分為試驗組與空白對照組各6只，適應性喂養1周。將復方清熱顆粒用無菌去離子水溶解，試驗組每日予10倍臨床劑量復方清熱顆粒劑藥液 ［22 g/（kg·d）］灌胃，每日2次，連續5 d；第5日末次給藥后1 h，無菌心臟采血，4000 rpm×10 min離心，分離含藥血清后混合，-20℃冰箱保存備用。（2）空白血清的制備：選空白對照組6只健康大耳白兔，每天予滅菌蒸餾水［40 mL/（kg·d）］灌胃，每日2次，連續5 d；5 d后心臟采血，離心得空白血清，-20℃保存備用［5］。

1.6 外排泵表型陽性MDREcl的篩選 臨床分離的多重耐藥Ecl 13株，分別挑取單個菌落平板三區劃線于血瓊脂培養基中，35℃恒溫培育箱中培養18 h時，然后分別挑取單菌落，用無菌生理鹽水稀釋，比濁儀調節菌液濃度值至0.5麥氏濃度（約108CFU/mL），再依次稀釋至104CFU/mL。同法配制EclATCC13047作為質控。分別配制含不同濃度CIP和CIP+CCCP的MH瓊脂平板，抗生素和培養液按1∶9比例配制，CIP終濃度分別為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64，128，256 μg/mL，CCCP終濃度為2.56 μg/mL（該質量濃度對細菌外排泵有較好抑制作用，且對細菌生長無影響［6］）。將13株MDR-Ecl分別接種于已配制好的含不同濃度CIP和含不同濃度CIP+CCCP的MH瓊脂平板中，細菌接種量為104CFU/mL，35℃恒溫培育箱中培養18 h，采用瓊脂對倍稀釋法測出各組CIP的MIC值，并設一空白對照組和只含2.56 μg/mL CCCP的陰性對照組。以含CCCP時CIP的MIC值較不含CCCP的MIC值降低≥4倍作為外排泵表型陽性判讀標準［7］。共篩選出10株外排泵表型陽性的MDR-Ecl，分別為E1～5、E8、E10～13，P＝0.01，差異有統計學意義（P＜0.05）。空白平皿及只含2.56 μg/mL CCCP的MH平板上細菌生長良好。具體MIC值見表1，圖1。

表1 應用CCCP前后CIP對MDR-Ecl的MIC值變化（μg/mL）變化（P＝0.01）

圖1 CIP和CIP+CCCP對MDR-Ecl MIC值（μg/mL）變化（P＝0.01）

1.7 外排泵表型陽性MDR-Ecl藥敏試驗 分別測定空白血清、含藥血清、中藥復方清熱顆粒、中藥+CIP、空白血清+CIP、含藥血清+CIP及中藥+CIP+CCCP等不同藥物組成對外排泵陽性MDR-Ecl的MIC值變化，以Ecl ATCC13047為質控菌株。結果按CLSI 2012版標準判讀［8］。（1）含藥血清及空白血清的MIC值測定：配制20 mL含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿，含藥血清及空白血清含量分別為0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL。分別接種上述外排泵表型陽性的多重耐藥Ecl菌懸液及質控菌株菌懸液于含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿中，細菌接種量約為104CFU/mL，于35℃恒溫箱培育18 h。上述4個含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿上的Ecl菌菌株均生長良好，未測出含藥血清及空白血清的MIC值。（2）中藥復方清熱顆粒MIC值測定：用電子天平準確稱取 2g復方清熱顆粒，先用少量DMSO（占總體積＜1％）溶解，加入10 mL無菌去離子水中，使之充分溶解，過濾除菌備用。配制含中藥復方清熱顆粒的MH瓊脂平皿，中藥終濃度分別為：0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL。分別接種上述外排泵表型陽性MDR-Ecl菌懸液及質控菌株菌懸液約104CFU/mL，并于35℃恒溫箱培育18 h后測定CIP的MIC值。當中藥原液濃度為20 mg/mL時，所有菌株均無生長；在中藥原液終濃度為0.625 mg/mL的MH培養平板中，可見各菌株均有生長。記錄不同濃度復方清熱顆粒MIC值見表2。（3）測定。

表2 復方清熱顆粒（mg/mL）對MDR-Ecl的MIC值

1.8 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量數據以（±s）表示，采用配對t檢驗方法進行統計學處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中藥+CIP組MIC值 見表3，圖2。結合（2）試驗結果，制備含中藥復方清熱顆粒和CIP的MH瓊脂平皿，分為4組，每組CIP的質量終濃度均分別包括：0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，中藥終濃度分別為：0.625、1.25、2.5 mg/mL。接種各細菌菌懸液及質控菌株懸液并于恒溫箱中培育，具體試驗方法同上。CIP組和CIP+中藥0.625 mg/mL組、CIP組和CIP+中藥1.25 mg/mL組MIC值相當（P＞0.05），CIP組和 CIP+中藥 2.5 mg/mL組 MIC值下降（P＜0.05）。

表3 復方清熱顆粒（mg/mL）作用下CIP的MIC值（μg/mL）

圖2 CIP和CIP+復方清熱顆粒（2.5 mg/mL）的MIC值變化（μg/mL）（P＝0.015）

2.2 空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值 見表4，圖3。分別配制含空白血清+CIP組和含藥血清+CIP組MH瓊脂平皿，空白血清體積為2 mL（1組），含藥血清體積分別為：0.5 mL、1 mL、2 mL（命名為2、3、4組），CIP終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。分別接種上述菌懸液及質控菌株菌懸液于MH瓊脂平皿，細菌接種量及培育時間同上。CIP組、空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值比較，差異無統計學意義（P＜0.05）。

表4 應用空白血清、含藥血清前后CIP對MDR-Ecl的MIC值變化（μg/mL）（P＞0.05）

圖3 應用空白血清、含藥血清前后CIP對MDR-Ecl的MIC值變化（μg/mL）（P＞0.05）

2.3 中藥復方清熱顆粒＋CCCP＋CIP組MIC值 見表5，圖4。制備MH瓊脂平皿，每個MH瓊脂平皿中復方清熱顆粒的終濃度均為 2.5 mg/mL，CCCP的濃度為2.56 μg/mL，CIP質量濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL。同樣試驗方法進行細菌接種及恒溫孵育。CIP+CCCP組與中藥+CIP+CCCP組MIC值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表5 復方清熱顆粒劑+CIP+CCCP組CIP的MIC值（μg/mL）（P＝0.031）

圖4 CIP+CCCP和CIP+CCCP+復方清熱顆粒2.5 mg/mL時CIP的MIC值（μg/mL）

3 討論

近年國內外越來越多研究發現，Ecl細菌外膜上存在特殊的AcrAB-TolC主動外排泵系統，能將進入菌體內的藥物不斷排出，使菌體內的藥物濃度降低從而導致耐藥。由于主動外排泵系統作用底物廣泛，故被認為是細菌產生耐藥性尤其是多重耐藥的重要原因。外排泵抑制劑（EPIs）可以逆轉細菌對抗生素的敏感性，成為改善細菌耐藥的途徑之一。但這些抑制劑目前大多仍處于試驗階段，許多在體外活性良好的外排泵抑制劑由于安全性、特異性以及機制尚不明確等諸多原因而未應用于臨床治療，因而研發新型外排泵抑制劑或其他途徑逆轉細菌耐藥性的藥物成為趨勢［9］。

本文從中醫學角度出發，探討中藥對細菌主動外排泵作用的影響。實驗以多重耐藥Ecl為實驗菌株，中藥復方清熱顆粒及其含藥血清為主要研究對象，主要觀察在分別聯合含藥血清、中藥復方清熱顆粒及CC-CP前后環丙沙星（CIP）的MIC值變化。通過分析結果可以發現：（1）空白血清組、含藥血清組為測得最小抑菌濃度，其分別聯合CIP后MIC值變化差異無統計學意義，均說明含藥血清不能改善Ecl的耐藥性；（2）CIP＋中藥復方清熱顆粒組與單用CIP組比較，加入中藥復方制劑后CIP的MIC值明顯下降（P＜0.05），說明一定濃度復方清熱顆粒具有抑菌效果，且與西藥聯合后能明顯改善外排泵陽性多重耐藥Ecl對環丙沙星的耐藥情況。（3）中藥＋CIP＋CCCP組MIC值較CIP＋CCCP組MIC值顯著下降（P＜0.05），說明當CCCP阻斷外排泵能量來源后，中藥原液仍可以通過其他作用機制改善環丙沙星耐藥情況，既往研究顯示復方清熱顆粒對耐藥細菌外膜通透性具有干預作用，使外膜蛋白含量增加從而降低細菌耐藥性［10］，可能與中藥干擾外膜通透性機制有關。

［1］Maraki S，Samonis G，Karageorgopoulos DE，et al.In vitro antimicrobial susceptibility to isepamicin of 6，296 Enterobacteriaceae clinical isolates collected at a tertiary care university hospital in Greece［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56（4）：3067-3073.

［2］Manzur A，Tubau F，Pujol M，et al.Nosocomial outbreak due to extended spectrum b-lactamase-producing Enterobacter cloacae in a cardiothoracic intensive care unit［J］.J Clin Microbiol，2007，45（6）：2365-2369.

［3］Sanders WE，JR，Sanders CC.Enterobacter spp.：Pathogens poised to flourish at the turn of the century［J］.Clin Microbiol Rev，1997，10（12）：220-241.

［4］于一云，王紅，張淑文，等.復方清熱顆粒劑對MRSA PBP2a表達影響的實驗研究［J］.中國中醫急癥，2009，18（9）：1483-1486.

［5］楊鈞，張淑文，陰宏，等.復方清熱顆粒劑含藥血清對超廣譜-內酰胺酶的抑制作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2007，13（11）：40-43.

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［7］胡小行，李國明，劉軍，等.主動外排系統與Ecl多重耐藥關系的研究［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32（1）：18-20.

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［9］馬真，蔡紹曦，佟萬成.耐碳青霉烯類Ecl外排泵AdeABC的研究［J］.南方醫科大學學報（J South Med Univ），2011，31（8）：1378-1381.

［10］王靜，張淑文，王紅，等.復方清熱顆粒劑對耐藥大腸桿菌外膜通透性的干預作用［J］.中國中醫急癥，2009，11（18）：1845-1848.

Vitro Medicine Sensitive Experiments about Compound Qingre Granules on Efflux Pumps of Multidrug-resistant Enterobacter Cloacae

CHEN Yujiao，REN Aimin，WANG Hong，et al.Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Objective：To explore the effect of Compound Qingre Granules on efflux pumps of multidrug-resistant enterobacter cloacae.Methods：Ⅰ.The preparation of drug serum：healthy rabbits with big ears were selected and randomly divided into two groups：6 in experimental group and 6 in control group.After one week of adaptive feeding，experimental group was given Compound Qingre Granules by intragastric administration twice a day for 5 days.The control group was given sterile purified water in the same way with the same dose.Blood was drawn from heart after 60 minutes at the last medication and was centrifuged to separate drug serum and blank serum，which were then conserved in-20℃.Ⅱ.10 strains of efflux pump positive multidrug-resistant enterobacter cloacae were selected by using CCCP.The minimal inhibitory concentration of ciprofloxacin was measured within and withiout Compound Qingre Granules，drug serum，blank serum and CCCP by agar dilution method.Results：Compound Qingre Granules could significantly reduce the MIC of ciprofloxacin to multidrug-resistant enterobacter cloacae.Conclusions：Compound Qingre Granules can alleviate the resisitance of multidrug-resistant enterobacter cloacae.

Enterobacter cloacae；Efflux pump；Compound Qingre Granules

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1460-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.025

2014-05-19）

北京市中醫藥管理局重點學科基金（京中醫科字【2012】250號）