重組人心肌肌鈣蛋白I基因工程菌的構(gòu)建與表達

丁祥瑞，汪建明，蔡勝和

(1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津石橋生物科技有限責任公司，天津 300457)

急性心肌梗死(acute myocardiacal infarction，AMI)是臨床常見的心血管疾病，據(jù)統(tǒng)計在心血管疾病患者中有 40%死于 AMI，所以，對 AMI診斷的研究一直倍受臨床研究的重視．AMI主要是根據(jù)臨床癥狀、心電圖和血清心肌酶譜的變化情況來診斷，但隨著科學(xué)研究的深入，這些診斷標準越來越受到專家們的質(zhì)疑．研究發(fā)現(xiàn)，人心肌肌鈣蛋白 I(human cardiac troponin I，hcTnI)在心肌受到微小損傷時出現(xiàn)早，持續(xù)時間長，且為心肌細胞所特有，因此 hcTnI正逐步取代其他的生化標志物成為診斷心肌損傷的首選生化指標[1–2]，特別是急性心肌梗死的診斷“金標準”[3–4]．

本文采用基因工程方法利用原核表達系統(tǒng)制備未添加任何序列標簽的重組 hcTnI，使其更接近天然蛋白和有更好的抗原性，為進一步制備高質(zhì)量抗體及開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的 hcTnI診斷試劑盒奠定實驗基礎(chǔ)，并促進hcTnI診斷標準化問題的研究．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 目的基因片段、載體和菌株

hcTnI全基因合成菌液由北京華大基因公司合成；pET-11a載體菌液購自北京天恩澤公司；大腸桿菌(E.,coli)DH5α克隆菌株和 BL21(DE3)表達菌株均為本實驗室保存．1.1.2 酶和實驗試劑

Nde I內(nèi)切酶、Bam HI內(nèi)切酶、T4,DNA 連接酶，紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，OMEGA公司；DNA marker，上海純優(yōu)生物科技有限公司；hcTnI抗體，Sigma公司；其他試劑均為分析純．

1.1.3 實驗儀器

高性能臺式離心機，Thermo Scientific；電泳儀，北京市六一儀器廠；恒溫搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 重組hcTnI基因表達序列的設(shè)計

NCBI網(wǎng)站 GeneBank基因文庫[5]提供的人心肌肌鈣蛋白 I(hcTnI)基因序列號：NM_000,363.4，大小630,bp．本實驗設(shè)計在目的基因的5’端添加Nde I限制性內(nèi)切酶和3’端添加Bam HI限制性內(nèi)切酶位點；并對上游引物的第2位和第4位密碼子的第3個堿基簡并定點突變，以便在表達過程中可提高表達產(chǎn)量．確定目的基因設(shè)計要求，委托北京華大基因公司進行全基因合成hcTnI目的片段．

1.2.2 重組hcTnI全長基因克隆獲得

將含hcTnI全基因序列的大腸桿菌液按1∶100接種至氨芐抗性(AMP)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒回收試劑盒提取菌液質(zhì)粒，經(jīng)Nde I限制性內(nèi)切酶和Bam HI限制性內(nèi)切酶雙酶切、1%瓊脂糖凝膠電泳，并把酶切的目的片段用凝膠試劑盒回收待用．pET-11a載體商品菌液也按1∶100接種至AMP抗性LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取載體質(zhì)粒，經(jīng) Nde I酶和 Bam HI酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收 pET-11a大片段質(zhì)粒．按物質(zhì)的量濃度比1∶3將切膠回收的pET-11a大片段質(zhì)粒和切膠回收的目的基因片段用 T4,DNA連接酶連接，4,℃連接16,h．將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 E.,coli DH5α 感受態(tài)菌株，均勻挑取轉(zhuǎn)化平板中的單克隆，提取質(zhì)粒．挑取陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證該克隆的正確性．

1.2.3 重組質(zhì)粒的表達和鑒定

將雙酶切鑒定正確的pET-11a-hcTnI/E.,coli DH5α單克隆擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞于 AMP抗性的 LB平板上，過夜培養(yǎng)，均勻挑取陽性單抗隆菌落提取質(zhì)粒，接種到 5,mL含1,mg/mL的 AMP抗性的 LB液體培養(yǎng)基中，37,℃、200,r/min過夜培養(yǎng)．再擴大轉(zhuǎn)接 500,mL AMP抗性的 LB液體培養(yǎng)基中，37,℃、200,r/min振蕩培養(yǎng)至A600為1.0后，加 1.0,mmoL/L的誘導(dǎo)劑 IPTG誘導(dǎo)，30,℃、200,r/min 振搖 4,h．4,℃、6,000,r/min 離心10,min收集菌體，加 20,mL PBS(10,mmoL/L，pH 7.4)重懸．超聲破碎，其條件為：功率 285,W，1.5,s工作，1.5,s休息，破碎30,min至菌液透亮．取破碎菌液于 4,℃、9,000,r/min離心 30,min，收集離心上清液，沉淀用等體積的 PBS重懸，分別取 30,μL誘導(dǎo)前菌液、誘導(dǎo)后菌液、破碎離心上清液和破碎沉淀重懸液，進行12%的SDS-PAGE電泳分析．

1.2.4 表達產(chǎn)物的免疫特性分析

將菌體超聲破碎后離心的上清液進行 SDSPAGE，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，蛋白免疫印跡反應(yīng)．用半干式轉(zhuǎn)移電泳儀電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜 2,h，5%脫脂奶粉封閉液 4,℃過夜，1×PBS洗膜，加入鼠抗 hcTnI單抗(1∶1,000)，37,℃結(jié)合 2,h，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶10,000)，37,℃結(jié)合 2,h，充分洗滌后ECL鑒定表達產(chǎn)物．

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)計的目的片段序列

在hcTnI基因5’端鉸鏈區(qū)轉(zhuǎn)錄成mRNA后形成一個穩(wěn)定的頸–環(huán)結(jié)構(gòu)，在翻譯時易形成位阻使酶結(jié)合能力減低或不能結(jié)合，從而造成目的蛋白的表達量低的問題[6]．所以，為了提高目的蛋白 hcTnI的表達產(chǎn)量，在hcTnI基因5’端第2位和第4位密碼子的第3個堿基進行簡并堿基突變；在目的基因序列的5’端添加Nde I限制性內(nèi)切酶和3’端添加Bam HI限制性內(nèi)切酶位點．

hcTnI全基因合成序列(627,bp)如下：

2.2 酶切回收目的基因片段和載體pET-11a大片段

將全基因合成的含有目的基因片段的菌液和pET-11a載體菌液分別接種于AMP抗性的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶 Nde I和Bam HI進行雙酶切，按照凝膠回收試劑盒回收酶切質(zhì)粒，結(jié)果如圖1所示．

由圖 1可知：雙酶切回收質(zhì)粒 DNA條帶進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠分析儀下拍照并分析，泳道1顯示雙酶切回收的目的基因條帶清晰大小約為630,bp 的片段，與(GeneBank NM_000363.4)公布的hcTnI條帶大小相符；泳道 2顯示只有 1個條帶，條帶的位置和載體pET-11a質(zhì)粒理論值一致．

2.3 克隆菌株中重組質(zhì)粒的酶切鑒定

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株 E.,coli DH5α感受態(tài)細胞，對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖 2所示．由圖 2可知：重組質(zhì)粒大小正確，酶切下的目的片段位置與理論相符，條帶清晰，附近無雜帶出現(xiàn)．陽性重組子被雙酶切成 2個片段，其中小片段為630,bp，符合目的片段的大小；大片段和陰性對照一致．以上實驗結(jié)果表明：目的基因已正確插入載體pET-11a中．

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Enzyme identification of recombined plasmid

2.4 重組菌株的誘導(dǎo)表達及鑒定

重組質(zhì)粒 pET-11a-hcTnI轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)．挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)，經(jīng) 1,mmoL/L的 IPTG誘導(dǎo)．誘導(dǎo)前后分別取樣并進行 12%的 SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示．

圖1 hcTnI和pET-11a的酶切回收Fig.1 Enzyme digestive and recovered product of hcTnI and the vector pET-11a

圖3 重組菌株的誘導(dǎo)表達Fig.3 Expression states of induced recombined stains

誘導(dǎo)后在相對分子質(zhì)量約 2.6×104處蛋白條帶明顯，與預(yù)期的 hcTnI蛋白相對分子質(zhì)量相符合．用凝膠條帶光密度軟件 BandScan掃描顯示，所表達的目的蛋白占總菌體蛋白的 30.1%．為了進一步確定目的蛋白的表達形式，取破碎離心上清液和相應(yīng)的PBS重懸沉淀液進行SDS-PAGE．由圖4泳道2可知：在相對分子質(zhì)量2.6×104處有顯著的條帶，與所設(shè)計重組菌株表達的目的蛋白hcTnI的相對分子質(zhì)量吻合；此條帶大部分存在菌體破碎的上清液中，說明本研究所構(gòu)建的重組菌株在該實驗的條件下，目的蛋白主要是以可溶性形式表達而非包涵體形式存在．

圖4 目的蛋白hcTnI在上清液和包涵體中的分布Fig.4 Distribution of hcTnI protein in the supernatant and inclusion body

2.5 目的蛋白的免疫學(xué)分析

在目的蛋白的最佳表達條件下，用 DEAESephrose離心交換層析柱、硫酸銨處理和苯基疏水柱純化得到純度為76%的目的蛋白．分別取蛋白Marker和重組菌株誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、純化后的目的蛋白，經(jīng)12%的 SDS-PAGE膠分離后，小心取膠轉(zhuǎn)膜，進行免疫印跡實驗，結(jié)果如圖5所示．

圖5 hcTnI的免疫印跡鑒定Fig.5 Identification of the purpose protein (hcTnI) by Western Blot

由圖 5可知，在相對分子質(zhì)量 2.6×104處，泳道2和泳道3有明顯條帶，說明重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后表達的目的蛋白與hcTnI抗體是特異性反應(yīng)的．由于純化的目的蛋白的純度達到72%，其他地方的顯色條帶有可能是降解的目的蛋白的某個抗原決定簇與抗體反應(yīng)所致．

3 討 論

肌鈣蛋白是心肌橫紋肌的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白[7]，是 3個亞單位構(gòu)成的復(fù)合體，分別為肌鈣蛋白C(calcinmbinding component，TnC)、肌鈣蛋白 I(in hibitory component，TnI)和肌鈣蛋白 T(tropomyosin-binding component，TnT)．TnI是 ATP酶的抑制性亞單位，可抑制肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合，阻止肌肉收縮．人心肌肌鈣蛋白I只存在心肌組織中，含量(濕質(zhì)量)為(5.7±0.6)mg/g，hcTnI的相對分子質(zhì)量為 2.6×104．天然來源的 hcTnI直接從心肌組織中通過生化方法提取，由于人心肌組織來源十分困難，要直接從心肌組織中大量純化抗原就十分困難和不經(jīng)濟；因此，利用基因工程的方法構(gòu)建hcTnI的原核高效表達重組體就顯得十分重要[8]．

在構(gòu)建重組工程菌時，本實驗選用的表達載體是pET-11a，在此系列的載體中，外源基因的表達受 T7噬菌體 RNA聚合酶調(diào)控，可用 IPTG誘導(dǎo)外源基因的表達．本研究構(gòu)建的重組體在誘導(dǎo)表達條件下以可溶性形式存在，不同于目前的hcTnI基因重組表達菌體目的蛋白以包涵體形式存在的報道[9]．這可能是由于選取表達載體和菌體的表達條件的差異所致，這樣不僅簡化后續(xù)的純化操作，也增加hcTnI穩(wěn)定性和抗原性．

本研究采用基因工程等技術(shù)設(shè)計和鑒定后，成功構(gòu)建了表達重組hcTnI的基因工程菌菌株．這解決了當前研制 hcTnI診斷試劑盒的過程中 hcTnI來源不足的問題，為進一步制備高特異性的抗體和推進hcTnI診斷標準化奠定基礎(chǔ)．

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