由松針制取三種葉綠素鈉鹽及其穩定性的研究

占汝真，武 健，付成鈺，方麗穎，王 吉，歐陽杰，*

（1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系，北京100083；2.林業食品加工與安全北京市重點實驗室（北京林業大學），北京100083）

葉綠素是一種從綠葉中提取的天然食用色素，其安全無毒，除被廣泛用作食品、化妝品的著色劑外，還具有抗誘變、抗氧化等活性[1]。但是，葉綠素不穩定且不溶于水，所以常常將其制成葉綠素銅鈉鹽以提高其穩定性。葉綠素銅鈉鹽是聯合國糧農組織、世界衛生組織（FAO/WHO）和我國食品添加劑標準委員會批準使用的天然綠色素，也是我國食品工業中唯一允許使用的綠色素[2-4]。但基于Cu2+的毒性，如果能將葉綠素制成其他金屬鹽，安全性將更高。鋅是人體所必需的微量元素，是體內多種酶的組成部分，參與機體內的各種新陳代謝，若將葉綠素改造為葉綠素鋅鈉鹽，可以使其兼具色素和鋅制劑的雙重作用[5]。同樣，制備出葉綠素鐵鈉，也可作為一種具有補鐵保健功能的天然綠色色素。葉綠素鐵鈉具有抗菌、抗病毒、抗過敏和促進組織再生等作用，是一種良好的造血細胞復合劑，對各種原因引起的白細胞減少癥及各種貧血有治療作用[6-7]。

迄今為止，從毛竹、紅松、榆樹等葉子制備葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉已經有了一定的研究，還有人利用蠶砂制備葉綠素鐵鈉，其葉綠素含量約為1%[8]，但蠶砂只分布于南方養蠶的地區。我國松樹資源分布廣泛，松針葉綠素具有抗菌、止血、降血壓、刺激細胞生成和清除體內超氧自由基等作用[9-10]。

此外，國內外有部分針對葉綠素鈉鹽穩定性的研究，但將三者穩定性進行對比的較少，且采用的方法是在實驗處理一段時間后進行一次測定，無法確定三種葉綠素鈉鹽穩定性隨處理時間延長產生的影響。因此，本研究以松針為原料制備葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉，并比較它們對光、熱、pH和氧化劑在一段時間內的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松針 采摘于北京地區的馬尾松；無水乙醇、氫氧化鈉、石油醚、硫酸、鹽酸、丙酮、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸亞鐵 均為分析純，北京化學試劑公司。

UV2550紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉的制取

1.2.1.1 松針的預處理 將新鮮松針用水洗凈風干，再用60℃熱風烘干至含水率12%左右；除去發黃的松針，粉碎后過60目篩，即得松針粉，備用。

1.2.1.2 葉綠素的萃取 稱取100g松針粉，將其置于1000mL燒杯中，加入450mL無水乙醇和50mL水拌勻，靜置12h，再用閃式提取器提取300s，抽濾；把濾液轉入蒸餾裝置濃縮，55℃減壓蒸餾，蒸至原濾液體積的1/3，即得葉綠素軟膏，其主要成分有葉綠素、β-胡蘿卜素、葉黃素等。

1.2.1.3 皂化分離提純葉綠酸鈉 向葉綠素軟膏中加入0.3mol/L NaOH調節pH至10～11，65℃皂化40min，稍冷卻轉入分液漏斗中，加入等體積的石油醚，激烈振搖，以萃取其中不皂化物。靜止分層，上層的石油醚層主要含未皂化的葉黃素、β-胡蘿卜素等，下層為已轉變的葉綠素鈉鹽——葉綠酸鈉。

1.2.1.4 葉綠素銅鈉、鋅鈉和鐵鈉的制備 將上述葉綠素鈉鹽用0.5mol/L HCl調節pH為6.0～6.5，65℃攪拌1h，此時生成脫鎂葉綠素鈉。再調節pH為2.0～3.0，攪拌反應1h。再滴加20g/100mL CuSO4溶液，逐漸析出結晶；當整體顏色由黃綠色變成墨綠色時，再多加2～3mL CuSO4液體，結晶1h，過濾、水洗、干燥得葉綠素銅酸[11]。將上述葉綠素銅酸溶于適量丙酮中，加入5%NaOH-乙醇溶液，隨著溶液的加入葉綠素銅酸逐漸溶解，當調至pH=10.0時，又開始變稠，析出結晶，調到pH=11.0時結晶1h，過濾、用丙酮洗滌三次、真空干燥得藍黑色的葉綠素銅鈉結晶[12]。分別用ZnSO4和FeSO4代替CuSO4，以同樣的方法分別制備得到墨綠色有金屬光澤的葉綠素鋅鈉和墨色有金屬光澤葉綠素鐵鈉結晶[13-14]。

1.2.2 紫外-可見吸收圖譜的測定 將按上述制得的葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉鹽加蒸餾水配成一定濃度溶液，以蒸餾水作參比，分別在200～700nm波段進行全波長掃描。

1.2.3 葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的穩定性研究 分別將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成1×10-4g/mL的溶液，分別：a.置于黑暗、實驗室自然光（500Lux）和燈箱（4000Lux）中；b.置于50、60、70、80℃下；c.各用HCl和NaOH調節成pH為3.0、5.0、7.0、10.5和12.5；d.以H2O2（30%）為氧化劑，配制含有不同質量分數H2O2的葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉稀溶液。每隔一定的時間間隔，分別在其最大吸收波長處測吸光度。

保存率（%）=色素溶液不同時間點時在最大吸收波長處測得的吸光值/色素溶液在最大吸收波長處的初始吸光值×100

2 結果與討論

2.1 從松針制備葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉

以松針為原料，經過葉綠素提取、皂化、酸化、銅代（或鋅代、鐵代）、加堿成鹽等步驟，可分別制得葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉。其中，葉綠素銅鈉為墨綠色具有金屬光澤的結晶，以松針原料計產品得率為1.99%，其水溶液呈深綠色；葉綠素鋅鈉為綠色具有金屬光澤的結晶，得率為1.74%，水溶液呈翠綠色；葉綠素鐵鈉為黃褐色具有金屬光澤的結晶，得率為2.24%，水溶液呈茶黃色。

2.2 葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的紫外-可見吸收光譜

圖1 紫外-可見光吸收圖譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra

葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的紫外-可見吸收光譜如圖1所示。葉綠素銅鈉的最大吸收波長為402nm，葉綠素鋅鈉的最大吸收波長為415nm，葉綠素鐵鈉在405nm處有一微弱吸收峰。文獻中，葉綠素銅鈉的最大吸收波長為405nm和630nm[15]，葉綠素鋅鈉的最大吸收波長為410nm[16]，葉綠素鐵鈉的最大吸收波長為405nm，三者的最大吸收波長均與文獻中的較為一致[17]。

2.3 光照對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉和葉綠素鐵鈉穩定性的影響

將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉放置在不同光照條件下檢查其穩定性，結果見圖2。葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉在黑暗條件下穩定性較好，10h后保存率均在80%以上；在室內自然光和強光照射下，三者均加快分解，其中葉綠素銅鈉的穩定性最好，自然光照10h后保存率為78.76%，強光照射10h后保存率為73.24%。葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的光穩定性明顯不如葉綠素銅鈉。

圖2 不同光照條件對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩定性的影響Fig.2 Effect of light irradiation on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin and sodium iron chlorophyllin

2.4 溫度對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩定性的影響

將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉放置在不同溫度條件下檢查其穩定性，結果見圖3。葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉在50℃下穩定性較好，其中葉綠素鋅鈉的穩定性最好，12h后保存率為88.99%，葉綠素銅鈉12h后的保存率為80.49%。在70℃以下葉綠素鋅鈉和葉綠素銅鈉的保存率均在80%以上。葉綠素鐵鈉對溫度的穩定性較差，70℃條件下12h后保存率只有57.40%。超過80℃后，三者均分解加劇，溶液褪色[18-19]。

圖3 不同溫度對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩定性的影響Fig.3 Effect of heat treatment on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin and sodium iron chlorophyllin

2.5 pH對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩定性的影響

葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成一定濃度溶液后為堿性溶液，再將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成不同pH溶液檢查其穩定性，結果見圖4。pH的變化會引起葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的異構化。對于葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉來說pH越高，異構化后得到的物質吸光值越大，在酸性條件下，溶液的吸光值降低，且酸度越高，溶液的顏色越淺，吸光值越小。

圖4 不同pH對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩定性的影響Fig.4 Effect of different pH on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin，and sodium iron chlorophyllin

2.6 不同濃度氧化劑對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩定性的影響

將葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉配制成含有不同濃度H2O2的溶液，檢查其穩定性，結果見圖5。H2O2會使葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉分解，且濃度越高分解越劇烈。在不同濃度情況下，葉綠素鐵鈉相對較為穩定，葉綠素銅鈉穩定性較差。當H2O2的溶液濃度為0.02%時，8h后葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的保存率均在50%左右；當H2O2的溶液濃度為0.1%時，8h后只有葉綠素鐵鈉的保存率大于50%；當H2O2的溶液濃度為0.5%時，8h后葉綠素鐵鈉的保存率為46.21%，而葉綠素銅鈉只有21.17%。

3 結論

以松針為原料制備葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉的得率分別為1.99%、1.74%和2.24%。相比之下，葉綠素銅鈉的光穩定性較好，葉綠素鋅鈉對溫度的穩定性好，葉綠素鐵鈉對氧化穩定性較好。從顏色來考慮，葉綠素鋅鈉的水溶液顏色為翠綠色，與葉綠素銅鈉的顏色相差不大，且其具有色素和鋅劑雙重作用，因此若將其應用作食品添加劑，將具有廣闊的發展前景。

圖5 不同濃度H2O2對葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉、葉綠素鐵鈉穩定性的影響Fig.5 Effect of H2O2on the stability of sodium copper chlorophyllin，sodium zinc chlorophyllin and sodium iron chlorophyllin

[1]Pimentel E，Cruces M，Zimmering S.A study of the inhibition/promotion effects of sodium-copper chlorophyllin（SCC）-mediated mutagenesis in somatic cells of Drosophila[J].Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2011，722（1）：52-55.

[2]楊立榮，胡斌，韓兆熊，等.葉綠素銅鈉鹽的制備[J].浙江大學學報，1998，32（6）：745-752.

[3]Tadashi Kunieda，Toyoki Amano，Yuzo Shioi.Search for chlorophyll degradation enzyme，Mg-chelatase，from extracts of chenopodium album with native and artificial substrates[J].Plant Science，2005，169：177-183.

[4]Simon D，Hellwell S.Extraction and quantification of chlorophyll a from freshwater green algae[J].Water Res，1998，32（7）：2220-2223.

[5]王效山.新型食品添加劑葉綠素鋅研究[J].食品科學，1995（9）：48-49.

[6]向紀明，王琳，潘曉輝，等.蠶沙中葉綠酸銅鈉、葉綠酸鐵鈉的提制及應用[J].安康師專學報，1999，11（3）：41-42.

[7]遲翠翠，翟二林，李春燕，等.芹菜葉綠素鐵鈉與其他補血藥物功效的比較研究[J].食品科學，2013，34（7）：289-292.

[8]胡豐林.松針的利用價值分析[J].生物學雜志，1996（2）：25.

[9]劉曉庚，陳梅梅.我國松針的開發利用研究進展[J].糧食與食品工業，2003（3）：25-29.

[10]鄭光耀，何玲，薄采穎，等.松針葉綠素-胡蘿卜素軟膏體外清除自由基及體內抗氧化作用的研究[J].時珍國醫國藥，2013，24（4）：815-817.

[11]Owen R Fennema.Food Chemistry[M].Beijing：Light industry Press，2003：552-557.

[12]張海英，蔣申蓉，朱嘉玉，等.荷葉葉綠素銅鈉鹽的制備和穩定性研究[J].內江師范學院學報，2010，25（10）：55-57.

[13]曾家豫，武偉國，孔維寶，等.紅三葉葉綠素鋅鈉的制備及其穩定性研究[J].西北師范大學學報，2012，48（6）：82-88.

[14]李祥，文星，房媛，等.葉綠素鐵鈉鹽的制備[J].食品與發酵工業，2012，38（4）：77-81.

[15]鄧文燦，朱僚輝.松針葉綠素銅鈉的制備[J].山東化工，2001，30（4）：7-8.

[16]游秀花，林瑞余，蔡碧瓊，等.杉木葉綠素鋅鈉的制備工藝及穩定性[J].福建林學院學報，2007，27（2）：126-129.

[17]王立娟，李堅，葉結旺.松針葉綠素鐵鈉的制備及穩定性研究[J].林業科技，2004，29（2）：43-45.

[18]王修東，樓飛群，賈天亮，等.葉綠素銅鈉穩定性影響因素研究[J].中國藥業，2012，21（14）：20-21.

[19]Ferruzzi M G，Schwartz S J.Thermal degradation of commercial grade sodium copper-chlorophyllin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（18）：7098-7102.