基于酸性電解水處理的金槍魚殺菌技術研究

高 萌，張 賓，*，勵建榮，柳佳娜，蘇意誠

（1.浙江海洋學院，食品與醫藥學院，浙江舟山316000；2.渤海大學，化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013；3.俄勒岡州立大學，海洋食品研究與教育中心，美國俄勒岡州97403）

金槍魚肉富含蛋白質、維生素A、D和微量元素，尤其二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）等n-3多不飽和脂肪酸、蛋氨酸和牛磺酸等含量豐富，是國際營養學會重點推薦的健康食品[1]。對于金槍魚加工利用，一般將其冷凍后制成凍金槍魚肉，進而用來制成生魚片、壽司、調味及罐裝食品。金槍魚生魚片既保持了大部分營養物質又具有鮮美的滋味，因而備受廣大消費者青睞。作為高品質生魚片進行食用，必須具備微生物含量低、肌肉色澤鮮艷及解凍血水汁液滲出少等條件[2]。新鮮金槍魚肉帶菌量較少，如在加工過程中采取無菌操作而制備出的生魚片，可滿足人們生食的衛生要求。但實際在生魚片貯運及加工過程中，遭受二次污染的機會很多，根本無法做到無菌操作，因此生魚片在未經進一步加工滅菌情況下被直接食用，極有可能因魚肉中的微生物超標而引發食物中毒等多種食源性疾病[3]。

消費者在食用生魚片時，通常以綠芥末和醬油作為殺菌佐料，認為通過醮食方式即可起到有效殺滅微生物效果。而隨著因食用生魚片而引發的食源性疾病問題的頻發，使得越來越多消費者對于芥末、醬油等殺菌佐料的實際效果產生了疑問[4]。崔竹梅等[5]對草魚魚片的菌落總數和菌相進行了研究，并探討了生姜、醬油、醋等對于生魚片的殺菌效果，但其并未提出具體殺菌調味劑配方。郭姍姍等[6]采用臭氧水和二氧化氯處理脆肉鯇魚片，取得了良好減菌化效果，但此種強氧化劑殺菌處理方式對于魚片品質影響較大。龔婷等[7]研究發現，在鮮草魚片加工過程中，切片及后續浸泡工序是減少其遭受二次污染的關鍵控制點。

酸性電解水作為一種新興殺菌溶液，首先由日本研發成功，并被指定為一種安全的食品殺菌劑，用于殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌等，效果十分顯著[8]。張向陽等[9]采用pH2.35酸性電解水清洗鮮切胡蘿卜，在低耗水條件下即可對鮮切胡蘿卜達到顯著抑菌效果。藍蔚青等[10]的研究發現pH2.62、ACC為41.5mg/L的酸性電解水能在短時間內抑制帶魚中微生物的生長繁殖，同時明顯減緩TVBN含量的升高，可使帶魚冷藏貨架期延長2～3d。目前，國內外關于電解水的殺菌應用研究，絕大多數均集中在酸性較低（pH＜2.7）的電解水方面，而較低pH對于食品品質（尤其水產品）、包裝運輸材料腐蝕性大，且由于強酸性電解水制造成本高、受外界有機物影響較大、溶液中有效氯極不穩定等原因，極大地限制了其應用范圍[11-12]。關于酸性電解水在冷凍金槍魚及其生魚片制品中保鮮、殺菌應用研究還未見報道。本文針對冷凍金槍魚（鰹魚，Skipjack tuna）魚片在凍藏、加工及食用過程中微生物易污染問題，通過酸性電解水鍍冰衣技術、不同殺菌劑的殺菌效果及配方優化研究，旨在探討冷凍金槍魚貯藏品質保證的新方法，以及確定一種對于生魚片既能殺菌又符合口味要求的殺菌劑基礎配方。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚（鰹魚，Skipjack tuna） 浙江興業集團有限公司；食醋（總酸4.50～4.99g/100mL）、加飯酒（酒精度15.0%，V/V）、芥末醬（主要成分為西洋山葵和鮮山葵） 均為市售；結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（MUG）等 青島拓普生物工程有限公司；大腸埃希氏菌（ATCC 25922，Escherichia coli） 廣州市微生物研究所；實驗所用試劑 均為國產分析純。

FX-SASAL型電解水生成器 煙臺方心水處理設備有限公司；HS-1300型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HWS-270型智能恒溫恒濕箱 常州越科有限公司；DF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚預處理 冷凍金槍魚（鰹魚）貯藏于-55℃超低溫冰箱中，使用前采用溫鹽水法解凍。將魚肉浸置于NaCl濃度3.0%、溫度40℃的鹽水中90s后取出，濕紗布包裹，放置于4℃冰箱中，靜置解凍12h，使魚肉內部與表面溫度均一。解凍后魚肉進行整理、切分，備用。

1.2.2 酸性電解水制備 濃度為0.15%NaCl溶液，在電解水生成器中進行電解，電解條件為：電流0.2A、電壓6.3V、時間5min，獲得酸性電解水（Acidic Electrolyzed Water，AEW）。經測定該電解水pH為4.5、氧化還原電位為836.5mV、有效氯含量為31.7mg/L。實驗所用酸性電解水，制備后立即使用。

1.2.3 AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚的抑菌效果 首先將解凍金槍魚魚肉塊（10cm×5cm×5cm）置于含103cfu/mL大腸埃希氏菌溶液中1～2s（染菌），取出瀝干并于室溫下放置3h（增菌），然后置于-55℃超低溫冰箱中冷凍4h，取出立即浸沒于pH為4.5 AEW中3～5s（4℃），鍍冰衣后魚塊裝入塑料封口袋中，貯藏于-18℃冰箱中。每隔10d，測定樣品中細菌總數和大腸埃希氏菌數量。

實驗分組：蒸餾水鍍冰衣（空白組）和酸性電解水鍍冰衣（AEW組）。

1.2.4 殺菌劑對于解凍金槍魚的殺菌效果及配方優化 選用殺菌劑種類為食醋、芥末醬、加飯酒、AEW及（煮沸后）醬油。前期研究發現，所用食醋、芥末醬、加飯酒、AEW及（煮沸后）醬油樣品自身中，菌落總數均低于8cfu/g，大腸埃希氏菌均未檢出（注：未煮沸醬油本身細菌總數含量較高，因此采用煮沸殺菌處理）。實驗發現，煮沸后的醬油無殺菌活性，因此以食醋、芥末、加飯酒及AEW為影響生魚片殺菌效果的主要影響因素，進行如表1所示的4因素3水平正交實驗。具體操作：在符合衛生要求的廚房中，將解凍后金槍魚制備成生魚片（6cm×5cm×0.5cm），然后將生魚片浸沒于103cfu/g大腸埃希氏菌溶液中1～2s（染菌），取出瀝干并置于空氣中3h（增菌），再浸沒于不同殺菌劑中8～10s，取出后立即測定生魚片中菌落總數、大腸埃希氏菌的數量，優化獲得生魚片最佳殺菌劑組合。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Experimental factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 微生物測定方法 細菌總數測定參照GB 4789.2-2010進行；大腸埃希氏菌測定參照GB 4789.38-2012進行。

1.3 數據分析

對于金槍魚鍍冰衣處理、樣品細菌總數及大腸埃希氏菌的測定，均至少完成3個平行，數據處理采用SPSS 13.0統計分析軟件，結果為平均值±標準偏差。

2 結果與討論

2.1 AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚的抑菌效果

金槍魚鍍冰衣的后處理技術是為了防止魚體低溫貯藏及運輸過程中，肌肉表面出現干燥、油脂外溢等干耗甚至油燒現象。傳統自來水冰衣雖可防止魚體脂類和色素的氧化，但其附著力較弱、易脫落，因此無法有效防止魚體遭受腐敗及致病微生物的侵染與繁殖。蒸餾水、AEW冰衣對于冷凍金槍魚在凍藏（-18℃）過程中抑菌效果，如表2所示。蒸餾水鍍冰衣組：0～40d凍藏期內，魚體中細菌總數、大腸埃希氏菌數量無顯著性變化，可能是由于低溫貯藏暫時鈍化了微生物生長與繁殖；隨著貯藏時間延長（80～320d），細菌總數、大腸埃希氏菌顯著性增加（p＜0.05），其原因可能是部分耐低溫菌適應了低溫環境，且在解凍過程中恢復了一定繁殖能力，致使細菌總數、大腸埃希氏菌顯著性增加[13]。AEW鍍冰衣組：0～160d凍藏期內，魚體中細菌總數、大腸埃希氏菌始終保持在較低范圍內，且呈現出顯著降低趨勢（p＜0.05）；凍藏至320d時，魚體中細菌總數、大腸埃希氏菌有所回升，但仍顯著低于蒸餾水鍍冰衣魚肉。

表2 AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚的抑菌效果（-18℃）Table 2 Antibacterial effect of AEW coating ice on the frozen tuna（-18℃）

由此可見，AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚在整個貯藏期內（0～320d）均具有顯著的抑菌效果，尤其在（0～160d）內，可顯著降低魚肉中的微生物含量。研究發現，酸性電解水在溶液狀態時，由于外界光照、氧氣及加熱等作用下，易出現分解進而轉變成為普通水，因此如果直接應用，其實際殺菌作用時間相對較短[14]。此外，AEW碎冰同樣能表現出良好的抑菌活性，如對大腸桿菌、摩氏摩根菌等殺滅效果顯著，同時還可有效防止紅肉魚中組胺的形成與蓄積[15]。本研究中將AEW制成冷凍金槍魚的外包冰衣，在金槍魚貯藏過程中通過AEW冰中緩慢釋放的ClO-、ClO2-、O3、H2O2及[O]等活性物質，可有效抑制細菌的細胞質酶活性，并損壞細菌外層細胞膜進而導致細菌的死亡[16-17]，有效延長了酸性電解水有效抑菌作用時間，因此對金槍魚在較長冷凍貯藏期內均能表現出良好抑菌活性。

2.2 金槍魚生魚片殺菌劑的配方優化

2.2.1 不同殺菌劑的殺菌效果比較 食醋、芥末、加飯酒、（煮沸后）醬油及AEW對于金槍魚生魚片中細菌總數、大腸埃希氏菌殺菌效果，如表3所示。結果表明，相對于空白處理（蒸餾水），食醋、芥末及AEW均表現出顯著的殺菌活性，而煮沸后的醬油基本無殺抑菌活性（p＞0.05）。因此，選定食醋、芥末、加飯酒及AEW為基礎殺菌劑，進行下一步的單因素及正交優化實驗。

表3 不同菌劑對生魚片的殺菌效果Table 3 Antibacterial effect of different condiments on the tuna sashimi

2.2.2 單因素實驗結果 染菌后魚肉于室溫下放置3h后（增菌），浸沒于不同殺菌劑中8～10s，取出后立即測定生魚片中菌落總數，結果如圖1所示。隨著食醋添加體積不斷增大，其對生魚片的殺菌效果不斷增強；當食醋體積增加至8mL及以上時，殺菌效果改善作用不顯著（p＞0.05）。對于芥末的殺菌效果，隨著芥末添加量增加，其殺菌效果不斷增強；但考慮到生魚片在食用過程中，芥末會產生強烈刺激性感覺，因此在殺菌配方優化過程中以較低添加量（1～6mL）為主要研究范圍。加飯酒的殺菌活性相對較弱，但其仍能顯著降低生魚片中細菌總數含量。對于AEW的殺菌效果，當生魚片中添加量超多4mL后，其殺菌效果無顯著性改變（p＞0.05）。

2.2.3 正交實驗結果 在綜合考慮不同殺菌劑對于生魚片感官品質影響的基礎上，分別以對細菌總數、大腸埃希氏菌的殺滅效果為評價指標，獲得了金槍魚生魚片最佳殺菌劑組合及因素主次順序（表4）。對生魚片中細菌總數殺滅效果：食醋＞芥末＞AEW＞加飯酒，即當食醋8.0mL、芥末1.0mL、AEW 2.0mL、加飯酒1.0mL時，制備復合殺菌劑殺菌效果最佳（A2B3C1D1）。經驗證實驗（3個平行）發現，此組合處理生魚片菌落總數為40cfu/g，殺菌效果較好。對生魚片中大腸埃希氏菌殺滅效果：食醋殺菌效果最佳，而其他3種物質的影響情況基本相同，因此選定最佳配方組合為A1B3C1D1，即當食醋8.0mL、芥末1.0mL、AEW 1.0mL、加飯酒1.0mL時，制備復合殺菌劑殺菌效果最佳。經驗證實驗（3個平行）發現，此組合處理生魚片大腸埃希氏菌數為50cfu/g，殺菌效果較好。

圖1 不同殺菌劑對于金槍魚生魚片的殺菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different condiments on the tuna sashimi

由以上結果可知，對于金槍魚生魚片中微生物的安全控制，起到殺菌作用的最主要物質為食醋和芥末。在金槍魚等各種生魚片食用過程中，保持以8.0mL食醋加入約0.1g芥末（醬）的比例，保證生魚片完全浸沒于組合殺菌劑中8～10s，即可保證生魚片食用安全。相對于食醋和芥末，加飯酒的殺菌效果有限，但在生魚片食用過程中，其可起到一定增效殺菌效果之外，更有益的是可改善生食水產品中的腥味問題，因此可依據個人需求適當（＜1.0mL）加入。AEW作為一種安全的多功能水，在生食水產品中同樣可起到一定輔助殺菌效果，但添加量過高（≥2.0mL）會輕微影響殺菌調味料的感官品質，因此綜合各影響因素選定金槍魚生魚片最佳殺菌劑組合為：食醋8.0mL、0.1g芥末（醬）、1.0mL酸性電解水及少量加飯酒。AEW更為重要的應用價值在于其對于冷凍生魚片在長期凍藏過程中的抑菌作用，以及對于解凍生魚片的短期保鮮應用（結果將另文報道）等。

此外，針對正交實驗獲得的最佳殺菌劑組合，本研究進而采用了風味剖面分析法（GB12310-90），對其蘸食食用風味進行感官評價發現，金槍魚生魚片蘸食以上殺菌調味劑組合，無不良風味和強烈刺激性風味出現。經消費者嗜好感官檢驗（實驗室內部人員組成）發現，金槍魚生魚片蘸食以上殺菌調味劑可被大多數消費者接受。

3 結論

冷凍金槍魚從解凍、加工至最后進入消費者口中，要經歷很多環節和較長的時間，根本無法保證整個過程的無菌操作，因此選用有效的微生物控制手段，對于保障消費者的食用安全至關重要。本文以冷凍金槍魚（鰹魚）為原料，魚肉中細菌總數和大腸埃希氏菌為研究對象，通過酸性電解水鍍冰衣技術、不同殺菌劑殺菌效果比較及組合優化研究，發現pH4.5酸性電解水鍍冰衣在80d凍藏期內，可顯著抑制魚肉中的微生物繁殖與生長。同時，獲得了金槍魚生魚片的最佳殺菌劑組合，即食醋8.0mL、0.1g芥末（醬）、1.0mL酸性電解水及少量加飯酒，其對生魚片中的微生物殺滅效果顯著，可有效的保證消費者的生食安全需求。

表4 細菌總數和大腸埃希氏菌數正交實驗結果Table 4 Results of orthogonal experiment of total number of bacteria and Escherichia coli

[1]張青，王錫昌，劉源.中國金槍魚漁業現狀及發展趨勢[J].南方水產，2005，5（1）：68-74.

[2]張泓.真空冷卻紅外線脫水保鮮技術在金槍魚生魚片加工中的應用[J].漁業現代化，2004（3）：33-34.

[3]劉弘，羅寶章，秦璐昕，等.生食三文魚片副溶血性弧菌污染的定量風險評估研究[J].中國食品衛生雜志，2012，24（1）：18-22.

[4]毛雪丹，胡俊峰，劉秀梅，等.2003-2007年中國1060起細菌性食源性疾病流行病學特征分析[J].中國食品衛生雜志，2010，22（3）：224-228.

[5]崔竹梅，汪梅，蔣云升.生魚片食源性安全性評價[J].食品科學，2003，24（12）：128-131.

[6]郭姍姍，榮建華，趙思明，等.臭氧水處理對冰溫保鮮脆肉鯇魚片品質的影響[J].食品科學，2009，30（24）：469-173.

[7]龔婷，熊善柏，陳加平，等.冰溫氣調保鮮草魚片加工過程中的減菌化處理[J].華中農業大學學報，2009，28（1）：111-115.

[8]Issa-Zacharia A，Kamitani Y，Tiisekwa A，et al.In vitro inactivation ofEscherichia coli，Staphylococcusaureusand Salmonella spp.using slightly acidic electrolyzed water[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，110（3）：308-313.

[9]張向陽，王丹，馬越，等.應用酸性電解水清洗鮮切胡蘿卜的節水效果[J].食品工業科技，2013，34（6）：130-133.

[10]藍蔚青，謝晶.酸性電解水與溶菌酶對冷藏帶魚品質變化的影響[J].福建農林大學學報，2013，42（1）：100-105.

[11]謝軍，孫曉紅，潘迎捷，等.酸性電解水及其在食品工業中的應用[J].食品工業科技，2010，31（2）：366-373.

[12]龔泰石.酸性電解水的制備與消毒[J].中國公共衛生，2001，17（3）：283-284.

[13]白鳳翎，馬春穎，孫建華.冷凍食品解凍方式對細菌數量影響的研究[J].食品工業科技，2004，25（1）：53-54.

[14]莊琳懿.酸性氧化電位水的產生條件與作用的初步研究[D].上海：同濟大學，2007.

[15]Phuvasate S，Su YC.Effects of electrolyzed oxidizing water and ice treatments on reducing histamine-producing bacteria on fish skin and food contact surface[J].Food Control，2010，21：286-291.

[16]Mahmoud BSM，Yamazaki K，Miyashita K，et al.Preservative effect of combined treatment with electrolyzed NaCl solutions and essential oil compounds on carp fillets during convectional air-drying[J].International Journal of Food Microbiology，2006，106（3）：331-337.

[17]Huang YR，Hung YC，Hsu SY，et al.Application of electrolyzed water in the food industry[J].Food Control，2008，19：329-345.