巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因多態性及其與肉質的相關性研究

郭月英，任霆，張靜，李婧，袁倩，程海星，王樂，靳燁*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特 010018；2. 包頭市東河區食品藥品監督管理局，內蒙古包頭市 014000）

巴美肉羊是內蒙古巴彥淖爾市廣大畜牧科技人員和農牧民經過40多年的不懈努力和精心培育而成的肉羊新品種。該品種2007年通過國家畜禽資源委員會審定驗收，正式命名為巴美肉羊，是國內第一個具有自主知識產權的肉羊雜交育成品種[1-3]。巴美肉羊生長發育速度較快，產肉性能高。適合舍飼圈養、耐粗飼、采食能力強，適合農牧區舍飼半舍飼飼養。繁殖率較高，性成熟早。搞逆性強、羔羊育肥快，是生產高檔羊肉產品的優質羔羊[1,2]。近年來，巴美肉羊以其生長及屠宰性能好，肉質鮮嫩、無膻味等優點深受養殖企業、加工企業和消費者的喜愛。

小尾寒羊是我國寶貴的地方優良品種，屬于蒙古羊的一個亞系，是世界著名的綿羊多胎品種之一，肉毛兼用。小尾寒羊生長發育快、早熟、繁殖率高，肉用性能好[4-7]。在1986年出版的《中國綿、山羊品種志》中，小尾寒羊被列為地方優良品種。1987年小尾寒羊被納入國家良種基因庫[5]。

生肌決定基因（myogenic determination gene, MyoD）也稱肌肉調節因子（myogenic regulatory factor ,MRFs），該基因編碼特異的骨骼肌轉錄因子[8-9]。目前在哺乳動物中發現的生肌調節因子有 4種: MyoD、MYOG、Myf5和Myf6，這四個基因共同稱為MyoD基因家族，是影響肉品質和產量性狀的關鍵基因，已經被認定為影響肉質性狀的候選基因[9-13]。本試驗對 MyoD基因家族的成員之一Myf6 基因多態性與巴美肉羊、小尾寒羊肉質性狀的進行相關性研究，為Myf6基因對巴美肉羊、小尾寒羊肉質的影響提供有效理論依據。

1.材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗用102只巴美肉羊、56只小尾寒羊選至內蒙古巴彥淖爾市五原縣巴美肉羊養殖示范基地，試驗個體在相同飼養管理條件下飼養。用5mL EDTA真空采血管頸靜脈采血，干冰帶回，-70℃保存，用于提取全血基因組DNA。

TC-P2A 全自動測色色差計 上海生物生化試驗儀器公司；多孔恒溫水浴鍋 余姚遠東數控儀器廠；CL-M 嫩度儀 上海精密科學儀器有限公司；PCR儀 Biometra；凝膠成像系統 Bio-rad, USA ；Eppendorf 5417R低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf生物公司；BG-power 3500型穩壓穩流電泳儀北京百晶生物技術有限公司；水平電泳槽 北京百晶生物技術有限公司；核酸蛋白分析儀 Bio-rad,USA。

Takara Premix Taq ?Version 2.0（Loading dye mix ）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

全血基因組DNA使用天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進行提取。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定濃度，DNA 樣品稀釋至約100 ng/ μL 分裝后于 - 20℃冷凍保存。

1.2.2 肉質指標測定

試驗用羊在內蒙古漁蒙家食品有限公司進行肉質性狀指標測定。

肉質指標測定包括pH、肉色（色差 ）、嫩度（剪切力）、眼肌面積。羊胴體沿脊柱左右劈半，左半胴體宰后45 min測pH ，記做pH1，然后在4℃冷庫中懸掛排酸，24 h再次測pH ，記做pH2。取右半胴體的背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌，按參考文獻方法[14-15]，測定肉色、嫩度。

1.2.3 引物合成和PCR 條件

Myf6基因的引物參照NCBI公布的序列，上游引物：5’- GTGTTTCGGATCATTCCAGG-3’，下游引物：5’ - GAGGAAATGCTGTCCACGAT -3’，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

PCR 擴增反應總體積為25μL, 其中Taqmix12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，滅菌雙蒸水 10.5μL，50 ng/ μLDNA 模板 1μL。

反應條件為：94℃預變性3min，94 ℃變性30s，58℃退火30s，72 ℃延伸30s; 35 個循環, 最后72 ℃ 延伸10min，4℃保存。PCR 產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 單鏈構象多態性(SSCP)分析

取 2μL PCR 產物，加入 5μL變性緩沖液（98%去離子甲酰胺、10mmol/L EDTA（pH8.0）、0.025g/100mL 溴酚藍、0.025g/100mL 二甲苯氰）于PCR管中，混勻，在PCR儀中98℃變性10min。迅速取出PCR管，立即插入冰中，放置10min。120V，12% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳5h，銀染顯色。凝膠成像系統( Bio-rad, USA )拍照分析, 判讀基因型。

1.2.5 統計分析

利用SPSS 11.5軟件統計各種基因型的分布情況,分析巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因不同基因型與肉質性狀的相關性。

2.結果與分析

2.1 Myf6 基因PCR結果

PCR擴增巴美肉羊Myf6基因, 所得PCR 產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果如圖1所示。

圖1 Myf6 PCR擴增結果Fig.1 PCR products of Myf6 gene

由圖1可以看出，擴增得到的片段與目的片段大小一致，為300bp左右，擴增條帶清晰，特異性良好, 可以進行SSCP分析。

2.2 PCR-SSCP 檢測結果

Myf6基因PCR-SSCP 電泳結果如圖2所示。

圖2 Myf6基因的SSCP電泳圖Fig.2 PCR-SSCP of the Myf6 gene

對102 只巴美肉羊、56只小尾寒羊Myf6的擴增產物進行PCR-SSCP檢測，結果如圖2 ，從圖2可以看出,在兩個品種的 Myf6基因擴增片段存在多態性。發現有2種不同基因型，根據條帶差異，分別命名為AA和AB型。

2.3 等位基因頻率和基因型頻率的統計

巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因的基因型及頻率及等位基因頻率、多態信息含量如表1、2所示。

表1 Myf6基因在巴美肉羊中的基因型頻率、等位基因頻率和多態信息含量Table 1 Genotype and allelic frequencies and PIC of Myf6 in Bamei sheep

表2 Myf6基因在小尾寒羊中的基因型頻率、等位基因頻率和多態信息含量Table 2 Genotype and allelic frequencies and PIC of Myf6 in Small fat- tail sheep

從表1 和表2可以看出，在巴美肉羊、小尾寒羊群體中發現了AA和AB 兩種基因型，均沒有發現BB純合子基因型。在巴美肉羊群體中，AA 基因型個體占多數，在小尾寒羊群體中，AB基因型型個體占多數，呈偏態分布。在兩個品種群體中，A等位基因的分布頻率遠高于B，故A等位基因為絕對優勢基因。B 等位基因均以雜合子的形式和較小的頻率存在于群體中。多態信息含量是指在連鎖分析中一個遺傳標記多態性可提供的信息量的度量。巴美肉羊、小尾寒羊的多態信息含量分別為0.26和0.34，均屬于中度多態(PIC > 0. 5為高度多態, 0. 25 < PIC < 0. 5為中度多態, PIC < 0. 25為低度多態)[16]。

2.4. Myf6不同基因型與巴美肉羊肉質相關性的分析

巴美肉羊Myf6的基因型與肉質指標的相關性如表3所示。

表3 Myf6不同基因型對巴美肉羊肉質的影響Table 3 Effects of genotypes on meat quality traits in Bamei sheep

由表3可以看出，巴美肉羊AA型與AB間各項肉質指標均無顯著性差異，但AA型在背最長肌、股二頭肌處有嫩度優于AB型的趨勢，而在股二頭肌處，兩者的嫩度基本沒有差別。AA型的臂三頭肌的紅度值、亮度值均優于AB型， AA型的眼肌面積大于AB型。

表4 Myf6不同基因型與小尾寒羊肉質的影響Table 4 Effects of genotypes on meat quality traits in Small fat- tail sheep

由表4可知，在背最長肌處，小尾寒羊 Myf6基因的AA型與AB型的的紅度值有顯著性差異（p＜0.05），AA基因型顯著優于AB型。其余肉質指標無顯著差異，但AA型的背最長肌和臂三頭肌的嫩度有優于AB型的趨勢，在紅度值方面，股二頭肌的AA型的紅度值優于AB型，但在臂三頭肌處，AB型的紅度值較好。在黃度值方面，AA型的背最長肌處和股二頭肌處的黃度值均次于AB型，但在臂三頭肌處，AA型略優于AB型。在小尾寒羊的三個測定肉質部位，AA型的亮度值均略好于AB型。兩個基因型在pH1和pH2兩個指標方面基本相同。AA的眼肌面積有大于AB型的趨勢。

由表3 、表4可知, 盡管肉質指標無顯著差異, 但從Myf-6 基因的不同基因型個體表現來看,A A總體優于AB型，且在試驗群體中Myf-6 基因的A等位基因可以改善羊的眼肌面積。

3.結論與討論

從實驗結果可以看出， Myf6 基因屬中度多態性。在檢測的兩個群體中均沒有發現BB 純合子，B 等位基因以雜合子的形式存在，且頻率較小。Myf6基因對肉質性狀的影響作用總體不顯著, 但在小尾寒羊的背最長肌處， Myf6基因的AA型與AB型的的紅度值有顯著性差異（p＜0.05），AA基因型肉色顯著優于AB型。盡管Myf6 基因的不同基因型對肉質指標的影響無顯著差異, 但從Myf6 基因的不同基因型個體表現來看，AA基因型的眼肌面積大于AB基因型。A等位基因可以改善羊的胴體品質。另外，在兩個群體的三個肉質檢測部位，有AA型優于AB型的趨勢。

2008年孫文浩等在對雞的Myf6 基因遺傳多態性的研究中發現了3種基因型，AA、AB 和BB型，并推斷Myf6基因的多態性位點與雞的肌纖維密度和直徑以及部分胴體性狀有一定的相關性[17]。2005年朱礪等對12個品種豬的Myf6 基因研究中發現了AA和AB 兩種基因型，并發現B等位基因有增加實驗群體胴體瘦肉率和眼肌面積, 降低皮脂含量的作用。在該項研究的各個群體中，均未檢測到BB基因型[18]。2006年Kapelanski等在豬的研究中發現，Myf6 基因在啟動子區和第一外顯子處的變異均顯著影響滴水損失[19]。

本實驗目前未檢測到BB基因型，因此Myf6 基因是否存在BB基因型及其對羊肉質的影響作用還有待進一步擴大試驗樣本后深入研究。

[1]. 郟建梅. 巴美肉羊在河套地區肉羊產業中的支撐作用[J]. 中國草食動物, 2010, （1）： 130-132.

[2]. 高愛琴, 李虎山, 王志新, 等. 巴美肉羊肉用性能和肉質特性研究[J]. 畜牧與獸醫, 2008, 40(2)： 45-49.

[3]. 王海平. 巴美肉羊培育方法的研究與應用[C]//全國養羊生產與學術研討會議論文集. 2010.

[4]. 常新耀, 謝紅兵, 魏剛才. 小尾寒羊胴體不同部位礦物元素的比較研究[J]. 光譜實驗室, 2009, 26(2)：190-193

[5]. 閆運清. 小尾寒羊研究發展概況[J]. 山東畜牧獸醫, 2011, 32(6)： 22-24.

[6]. 曾勇慶, 王慧, 儲明星. 小尾寒羊肉品理化性狀及食用品質的研究[J]. 中國畜牧雜志, 2000, 36(3)： 6-8.

[7]. 曲祖乙, 盧秀芳. 小尾寒羊簡介[J]. 中國草食動物, 2003,（3）：50-51

[8]. Bhuiyan M S A, Kim N K, Cho Y M, et al. Identification of SNPs in MYOD gene family and their associations with carcass traits in cattle[J].Livestock Science, 2009, 126(1): 292-297.

[9]. Kapelanski W, Grajewska S, Kuryl J, et al. Polymorphism in coding and non-coding regions of the MyoD gene family and meat quality in pigs[J]. Folia Biologica, 2005, 53(Supplement 1): 45-49.

[10]. Verner J, Humpolí ?ek P, Knoll A. Impact of MYOD family genes on pork traits in Large White and Landrace pigs[J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2007, 124(2): 81-85.

[11]. Liu M, Peng J, Xu D, et al. Associations of MYF5 gene polymorphisms with meat quality traits in different domestic pig (Sus scrofa)populations[J]. Genetics and Molecular Biology, 2007, 30(2): 370-374.

[12]. Yin H D, Zhang Z C, Lan X, et al. Association of MyF5, MyF6 and MyOG gene polymorphisms with carcass traits in Chinese Meat Type Quality chicken populations[J]. J Anim Vet Adv, 2011, 10(6): 704-708.

[13]. Wyszyńska-Koko J, Pierzcha?a M, Flisikowski K, et al. Polymorphisms in coding and regulatory regions of the porcine MYF6 and MYOG genes and expression of the MYF6 gene inm. longissimus dorsi versus productive traits in pigs[J]. Journal of applied genetics, 2006, 47(2):131-138.

[14]. 靳燁. 高壓處理對鮮牛肉感觀性能的影響[D]. 北京： 中國農業大學. 1999.

[15]. 李永鵬. 宰后成熟對藏羊肉肉用品質及揮發性化合物的影響[D]. 蘭州： 甘肅農業大學. 2011.

[16]. 王瓊, 劉益平, 蔣小松, 等. MyoG 基因多態性與優質肉雞屠宰性狀和肉質性狀的相關性分析 [J]. 遺傳, 2007, 29(9)： 1089-1096.

[17]. 孫文浩, 朱慶, 蔣小松, 等. 雞 Myf6 基因遺傳多態性及其遺傳效應研究[J]. 遺傳, 2008, 30(1)： 71-76.

[18]. 朱礪, 李學偉. Myf-6 基因在不同豬種中的 PCR-RFLP 遺傳多態性及其遺傳效應分析[J]. 遺傳, 2005, 27(6)： 887-892.

[19]. Kapelanski W, Grajewska S, Kuryl J, et al. Polymorphism in coding and non-coding regions of the MyoD gene family and meat quality in pigs[J]. Folia Biologica, 2005, 53(Supplement 1): 45-49.