耐輻射球菌對Cu2+的去除效率

韓萬春，李銘鋒，田 兵，華躍進，盧振蘭

(1.吉林農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，吉林長春， 130118;2.浙江大學原子核農業(yè)科學研究所，浙江杭州 310029;3.山東省東營市環(huán)境保護局，山東東營 257000)

耐輻射球菌對Cu2+的去除效率

韓萬春1，李銘鋒2，3，田 兵2，華躍進2，盧振蘭1

(1.吉林農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，吉林長春， 130118;2.浙江大學原子核農業(yè)科學研究所，浙江杭州 310029;3.山東省東營市環(huán)境保護局，山東東營 257000)

耐輻射球菌是一種非致病菌，擁有極強的抗輻射、抗氧化特性，具有成為工程菌處理Cu2+的潛力。采用酶標儀測定Cu2+對耐輻射球菌的生長速度的影響，用電感耦合等離子光譜法測定菌液離心后得到的上清液Cu2+濃度。結果表明，當Cu2+初始質量濃度為1.36 mg/L時，耐輻射球菌對其清除效率為57.3%;當Cu2+初始質量濃度為6.28mg/L時，對其清除效率為35.4%。此外，用激光共聚焦顯微鏡觀察受到Cu2+脅迫的耐輻射球菌，發(fā)現(xiàn)球菌具有明顯的聚集效應。

耐輻射球菌;Cu2+;電感耦合等離子光譜法;去除效率

Cu2+污染存在于電鍍、冶金、化工等行業(yè)已早為人熟知。人體攝入過量Cu2+會引起一系列病變，急性Cu2+中毒可引起胃腸道黏膜刺激癥狀，惡心、嘔吐、腹瀉，甚至溶血性貧血、肝功能衰竭、休克、昏迷或死亡，慢性攝入過高的Cu2+，可引起兒童肝硬化;土壤中過量的Cu2+可間接污染農產品，Cu2+對水培青菜幼苗生長影響很大［1］;Cu2+對玉米生長的影響同樣嚴重，當c(Cu2+)=50 μmol/L時，邊緣細胞的死細胞數(shù)量達758個(存活率為24.8%)，當c(Cu2+)=100 μmol/L 時，存活率降低了17.54%［2］;Cu2+對鯽魚紅細胞、白細胞和血紅蛋白影響較大［3］，它通過食物鏈威脅人體健康，并造成環(huán)境的二次污染［4］。

目前，人們已經(jīng)提出了眾多去除Cu2+的方法。董靜［5］采用吸附法去除 Cu2+，左鳴等［6］提出用鐵氧體法去除廢水中的Cu2+，劉泊良等［7］采用改性碳納米管對水中Cu2+的去除作用，朱一民等［8］采用海藻酸鈉吸附Cu2+，滕洪輝等［9］采用納米光催化還原去除水中Cu2+。

耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)是Anderson等人于1956年在用x射線給腐敗的灌裝食品滅菌時發(fā)現(xiàn)的非致病性紅色球菌［10］，被譽為地球上最頑強的細菌之一［11］，該細菌具有驚人的電離輻射抗性和DNA修復能力，其輻射耐受劑量是大腸桿菌的幾百倍，是人類的幾千倍，具有耐輻射、抗氧化、非致病菌的優(yōu)良特性［12-13］。本研究正是基于耐輻射球菌如此多的優(yōu)良特性的基礎上而展開的。GB 25467-2010《銅、鎳、鈷工業(yè)污染物排放標準》規(guī)定，企業(yè)廢水總排放二級處理后的Cu2+質量濃度不超過2.0 mg/L，如果將耐輻射球菌作為廢水排放中Cu2+二級處理的工程菌株，可為微生物清除Cu2+污染提供條件［14］，將在環(huán)境修復方面上具有一定的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料選用耐輻射球菌作為工程菌、大腸桿菌作為對照菌株;TGY培養(yǎng)基(TRYPTONE 0.5%、YEAST 0.3%、D-glucose 0.1%，pH=6.4±0.2)用于培養(yǎng)耐輻射球菌;LB(TRYPTONE 0.1%、YEAST 0.5%、NaCL 0.10%，pH=7.5±0.2)用于培養(yǎng)大腸桿菌;用Spectra Max M5測定OD600值;用PerkinElmer公司生產的 OpticalEmission Spectrometer optima 7300DV測定Cu2+濃度。

1.2 試驗方法

a.樣本前處理時，將耐輻射球菌劃平板，挑單菌落到5mL TGY培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)，試驗在無菌操作臺進行。

b.取1 mL培養(yǎng)好的菌液加入到200 mL的TGY培養(yǎng)基中，為保證初始培養(yǎng)基中菌體濃度相等，菌液培養(yǎng)到OD600=0.57。把搖好的菌分裝到20 cm滅菌試管中，每管5 mL。再分別加入10μL、50 μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)到試管中，每樣品做3次重復，利用酶標儀測定不同時間下的OD600的值。

c.用激光共聚焦顯微鏡觀察Cu2+處理后的耐輻射球菌的細胞聚集情況［15］。

d.利用電感耦合等離子光譜法(ICP-OES)測定培養(yǎng)基中Cu2+濃度，以計算耐輻射球菌對Cu2+的去除效率［16］。

初始樣測定:①將10 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培養(yǎng)基中，ICP-OES檢測出Cu2+質量濃度為1.36 mg/mL。②將50 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5mL的TGY培養(yǎng)基中，ICP-OES檢測出Cu2+質量濃度為6.28 mg/mL。

處理樣測定:① 將10 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培養(yǎng)基中，加入2 μL耐輻射球菌，生長到衰亡期，經(jīng)處理后，ICP-OES檢測出Cu2+質量濃度為0.58mg/mL。②將50μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培養(yǎng)基中，加入2 μL耐輻射球菌，生長到衰亡期，經(jīng)處理后，ICP-OES檢測出Cu2+質量濃度為4.06mg/mL。

2 試驗結果與分析

分析初始樣與處理樣Cu2+濃度之間的關系，并計算出耐輻射球菌對Cu2+的去除效率。用origin 75軟件繪制出不同Cu2+濃度對耐輻射球菌生長影響的生長曲線。

2.1 生長曲線的測定

向試管中加入Cu2+在一定程度上會影響耐輻射球菌的生長。為此利用酶標儀測定Cu2+脅迫下的耐輻射球菌生長曲線，以了解耐輻射球菌的生長狀況，如圖1所示。

圖1 Cu2+對耐輻射球菌生長的影響

耐輻射球菌初始透光度(OD600)為0.57時，加入不同濃度的Cu2+30℃培養(yǎng)。由空白樣本與Cu2+作用生長曲線可以看出，Cu2+用量對耐輻射球菌的生長影響小。重復多次試驗后用平板計數(shù)方法統(tǒng)計出，當OD600值為1.0時，1 mL菌液中耐輻射球菌的個數(shù)為108個。

為了說明Cu2+濃度對其他菌體的影響，測定Cu2+濃度對模式生物大腸桿菌的生長影響:當大腸桿菌在37℃LB培養(yǎng)基中，其OD600為0.24時，不同濃度的Cu2+對大腸桿菌的生長影響如圖2所示。

試驗結果表明，在大腸桿菌的生長過程中，Cu2+濃度對其生長具有促進作用。換言之，大腸桿菌對Cu2+濃度不敏感。但GB3838-2002《地表水環(huán)境質量標準》中明確提出了對糞大腸桿菌群的規(guī)定，因為其有一定的致病性，所以不能作為污水處理的工程菌。

圖2 Cu2+對大腸桿菌的生長影響

2.2 耐輻射球菌的聚集效應

在Cu2+的作用下，耐輻射球菌出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象(圖3)。

圖3 耐輻射球菌聚集現(xiàn)象

由于Cu2+的脅迫，耐輻射球菌出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。這可能是因為耐輻射球菌存在群體感應機制，以抵抗外來的脅迫。有文獻表明，這可能與某種金屬離子通道有關［4］。

2.3 不同濃度Cu2+作用下的菌體質量變化

試驗結果表明，耐輻射球菌對Cu2+有很強的耐受能力。按照表1數(shù)據(jù)向200 mL TGY培養(yǎng)基中加入各種濃度的Cu2+，培養(yǎng)48 h，精確量取100 mL菌液，離心30 min后(10000 r/min)收集菌體，把收集到的菌體用真空冷凍干燥儀干燥，稱取質量。

表1 不同濃度Cu2+加入后得到的菌體干質量

隨著Cu2+質量濃度的不斷增加，耐輻射球菌的菌體干質量不斷減少。Cu2+質量濃度低時，對耐輻射球菌的生長影響不大，但Cu2+質量濃度達到5.12 mg/L 時，即1600 μL Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)加入時，耐輻射球菌菌量開始快速下降。用SPSS18.0軟件進行顯著性分析，P值為9.06×10-7，遠小于0.5，效果顯著。

2.4 耐輻射球菌對Cu2+的去除效率

計算耐輻射球菌對Cu2+的去除率:

式中:ρ0為Cu2+初始質量濃度，mg/L;ρ為加入耐輻射球菌后的Cu2+質量濃度，mg/L。

當10μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)加入培養(yǎng)基中時，Cu2+質量濃度為1.36mg/L，加入700μL耐輻射球菌處理后，經(jīng)ICP-OES測得Cu2+質量濃度為0.58 mg/L，則去除率r1=(1-0.58/1.36)×100%=57.3%。

當50μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)加入培養(yǎng)基中時，Cu2+質量濃度為6.28mg/L，加入700μL耐輻射球菌處理后，經(jīng)ICP-OES測得Cu2+質量濃度為4.06 mg/L，則去除率r2=(1-4.06/6.28)×100%=35.4%。

由去除率可知，Cu2+的初始濃度越高，耐輻射球菌對Cu2+去除效率越低。

3 結語

采用酶標儀及ICP-OES等方法測定耐輻射球菌在Cu2+脅迫下生長曲線變化狀況及耐輻射球菌對Cu2+去除效率的研究。結果表明，耐輻射球菌對Cu2+具有很強的耐受能力;在Cu2+作用下耐輻射球菌有聚集現(xiàn)象;當Cu2+初始質量濃度為1.36 mg/L時，耐輻射球菌對Cu2+的去除率為57.3%;Cu2+初始質量濃度為6.28 mg/L時，耐輻射球菌對Cu2+的去除率為35.4%;耐輻射球菌具有作為企業(yè)二級處理時的工程菌的能力。企業(yè)可將耐輻射球菌作為處理含Cu2+廢水的工程菌，使處理后的水質達到GB25467-2010《銅、鎳、鈷工業(yè)污染物排放標準》的要求。今后，將用分子生物學手段進一步對Cu2+作用下耐輻射球菌的聚集現(xiàn)象進行研究，從而揭示其產生機理。

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Removal efficiency of Cu2+by Deinococcus radiodurans

HAN Wanchun1，LI Mingfeng2，3，TIAN Bing2，HUA Yuejin2，LU Zhenlan1
(1.College of Resources and Environment，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;2.Institute of Nuclear Agricultural Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China;3.Dongying Environmental Protection Agency of Shandong Province，Dongying 257000，China)

As a non-pathogenic bacteria，Deinococcus radiodurans is extremely resistant to ionizing radiation and oxidative stress and shows great potential in remediation of Cu2+pollution.In this study，we used the ELIASA plate reader and the ICP-OES，respectively，to monitor the growth rate of Deinococcus radiodurans and the Cu2+concentration in the supernatant after the bacterial solution was centrifuged.The results show that the removal efficiency of Cu2+by Deinococcus radiodurans reached 57.3%when the initial concentration of Cu2+was 1.36mg/L，and the removal efficiency dropped to 35.4%when the initial concentration of Cu2+increased to 6.28 mg/L.Meanwhile，using confocal laser scanning microscopy(CLSM)，we observed that Deinococcus radiodurans assembled at a high concentration of Cu2+.

Deinococcus radiodurans;Cu2+;ICP-OES;removal efficiency

X703.1

A

1004-6933(2014)01-0064-04

10.3969/j.issn.1004-6933.2014.01.013

國家自然科學基金(30830006，31170079)

韓萬春(1988—)，男，碩士研究生，研究方向為環(huán)境管理與規(guī)劃。E-mail:hs19880208@163.com

盧振蘭，教授。E-mail:zhenlan0431@163.com

(收稿日期:2013-06-21 編輯:高渭文)