O-羧甲基殼聚糖復凝止血海綿的體外表征與止血作用*

劉輝,鄒清河,吳迪,3

(1.廣州軍區武漢總醫院藥劑科,武漢 430070;2.湖北省宜都市第一醫院藥劑科,宜都 443300;3.湖北中醫藥大學藥學院2010級研究生班,武漢 430065)

O-羧甲基殼聚糖復凝止血海綿的體外表征與止血作用*

劉輝1,鄒清河2,吳迪1,3

(1.廣州軍區武漢總醫院藥劑科,武漢 430070;2.湖北省宜都市第一醫院藥劑科,宜都 443300;3.湖北中醫藥大學藥學院2010級研究生班,武漢 430065)

目的 研究自制O-羧甲基殼聚糖復凝止血海綿的理化性質,并考察其止血效果。方法采用冷凍干燥技術制備O-羧甲基殼聚糖復凝止血海綿。通過觀察外部形態,測定孔隙率、吸水率、密度等指標,表征止血海綿的理化性質;比較O-羧甲基殼聚糖止血海綿和市售吸收性明膠海綿對兔耳動、靜脈創傷出血模型的止血效果。結果O-羧甲基殼聚糖復凝止血海綿呈類白色,疏松多孔,具有一定的韌性,網狀結構均勻;孔隙率為67.23%,吸水率為38.77%,密度為0.043 4 g·(cm3)-1;該止血海綿的止血時間和出血量均低于市售吸收性明膠海綿,且無續發性再出血現象。結論該O-羧甲基殼聚糖復凝止血海綿理化性質穩定,止血效果可靠。

O-羧甲基殼聚糖;復凝止血海綿;體外表征;止血作用

殼聚糖具有顯著的止血功效,無毒,生物相容性良好,可生物降解[1],在止血領域應用前景廣闊。由于殼聚糖水溶性不佳,僅能溶于酸性溶液,極大地限制了其應用范圍。筆者通過在殼聚糖C-6位上引入羧甲基功能基團,合成了具有特定取代度(44.53%)和脫乙酰度(0.64)的O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl chitosan,O-CMC)[2],不僅改善了殼聚糖在水中的溶解性能,而且還賦予其抗菌、抗氧化、止血愈創等多重功效[3-4]。筆者以凝血酶為復凝止血因子,以O-CMC為止血基材和凝血酶固定化載體,以戊二醛為交聯劑,采用冷凍干燥技術優化并制得了具有凝血酶固定化作用的O-CMC復凝止血海綿。筆者在本實驗中擬對這一新型止血劑的體外表征進行詳細研究,并初步考察其止血效果,現報道如下。

1 材料與儀器

1.1 動物 日本大耳白兔5只,雄性2只,雌性3只,飼養環境及設施環境:普通級,體質量(2.6±0.2)kg,武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供,合格證號: 4210000241,使用證號:00070998,許可證號:SYXK (鄂)2008-0007。

1.2 試藥 O-CMC(自制,批號:20121124)、凝血酶(黑龍江迪龍制藥有限公司,規格:每瓶500 U,批號: 20100601),25%戊二醛水溶液(上海化學試劑采購供應五聯化工廠,批號:2010031S),甘露醇(青島明月海藻集團有限公司,批號:20100221),10%水合氯醛(廣州軍區武漢總醫院藥劑科制劑室,批號:20110923),吸收性明膠海綿(金陵藥業股份有限公司南京金陵制藥廠,批號:110208),其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 EMS-8A電熱式磁力攪拌器(天津市歐諾儀器儀表有限公司),LGJ-冷凍干燥機(軍事醫學科學院實驗儀器廠),電子天平(Mettler-Toledo Group), Quanta 2000型環境掃描電鏡(FEI公司)。

2 方法與結果

2.1 O-CMC復凝止血海綿的制備 稱取O-CMC適量,溶于0.9%氯化鈉溶液,配制濃度為2.49 mg·mL-1O-CMC溶液。將25%戊二醛用純化水稀釋,制得濃度為0.49 mg·mL-1的戊二醛溶液。將凝血酶溶于0.9%氯化鈉溶液,制得濃度為49.87 U·mL-1凝血酶溶液。取O-CMC溶液10 g,置25 mL燒杯,緩慢滴加凝血酶溶液5 mL;攪拌10 min,另取戊二醛溶液0.1 mL和5%甘露醇1 mL,加入上述溶液中,攪拌均勻。將該混合液倒入直徑6 cm培養皿,待完全膠凝后,置-20℃預凍24 h,再于-20℃真空冷凍干燥48 h,取出,即得O-CMC復凝止血海綿。

2.2 O-CMC復凝止血海綿的體外表征

2.2.1 O-CMC復凝止血海綿的外觀形態 肉眼觀察,自制止血海綿呈類白色,具有良好的韌性,疏松多孔,浸泡后膨脹且柔軟;電鏡下觀察網狀結構清晰,孔徑均勻,疏密合適,見圖1。

A.直觀圖;B.電鏡圖(×80)圖1 O-CMC復凝止血海綿的外觀形態A.direct-viewing figure;B.electron microscope figure(×80)Fig.1 Appearance and morphology of O-CMC multihemostatic sponge

2.2.2 O-CMC復凝止血海綿的孔隙率 選用10 mL量瓶,用乙醇定容,精密稱質量,記為Wa;取自制止血海綿,精密稱質量,記為W0,置于乙醇中脫氣,使乙醇充盈于多孔海綿的孔隙中,然后加乙醇至刻度,精密稱質量,記為Wb。將浸滿乙醇溶液的止血海綿取出,準確稱量剩余的乙醇與量瓶的總質量(Wc),按下式計算孔隙率:孔隙率(%)=(Wb-Wc-W0)/(Wa-Wc)× 100%,結果見表1。O-CMC復凝止血海綿的平均孔隙率為67.23%,這一較高孔隙率的止血海綿不僅可以提供足夠的空隙和網狀空間吸收更多的血液,而且能使海綿表面與創口有更大的接觸表面,有利于止血基材O-CMC和復凝因子凝血酶起到更為迅捷的止血作用。

表1 O-CMC復凝止血海綿的孔隙率Tab.1 Porosity ratio of O-CMC multi-hemostatic sponge

2.2.3 O-CMC復凝止血海綿的吸水率 將冷凍干燥制得的O-CMC復凝止血海綿剪成圓形、長方形和不規則形等3種形狀。分別精密稱定質量,記為W1;然后將不同形狀的止血海綿浸入純化水中,浸泡24 h后,取出并精密稱定質量,記為W2。自制止血海綿吸水率按如下公式計算:吸水率(%)=(W2-W1)/W1×100%,結果見表2。經測量計算,制得的O-CMC復凝止血海綿的平均吸水率為38.77%,不同形狀止血海綿的吸水率差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2.4 O-CMC復凝止血海綿的密度 將干燥的OCMC復凝止血海綿裁剪成規則的矩形,精密稱定質量,記為W;分別測量矩形的長、寬、高,計算其體積( V),即可根據公式求出止血海綿的密度(ρ),ρ=W/V,計算結果見表3,自制O-CMC復凝止血海綿的平均密度為0.043 4 g·(cm3)-1。

2.3 O-CMC復凝止血海綿的止血作用

2.3.1 止血效果驗證 采用10%水合氯醛麻醉日本大耳兔(腹腔注射,1～1.5 mL·kg-1,受試例數:5),麻醉后耳部脫毛。用外科手術刀在耳部外側中央處做一個創面2 cm×1 cm,其中耳動、靜脈橫向切斷,但不使耳朵切透,以防止血液從兔耳部內側流出而影響觀察效果。待傷口流出的血液充滿創面后,立即在兔耳出血處覆蓋止血材料,外平鋪加蓋紗布,并用50 g砝碼壓迫,每30 s觀察1次,直至出血停止。記錄傷口出血到止血完成的時間,即為止血時間;止血后,將止血材料與紗布一起置入稱量瓶密封,精密稱重,計算該值與止血前各種止血材料和所用紗布的總質量的差值,即得出血量:出血量(g)=止血后材料質量-止血前材料質量。

表2 不同形狀O-CMC復凝止血海綿的吸水率Tab.2 Water absorption ratio of O-CMC multihemostatic sponge with different shapes

表3 O-CMC復凝止血海綿的密度Tab.3 Density of O-CMC multi-hemostatic sponge

采用上述兔耳動、靜脈創傷出血模型進行止血實驗。結果顯示,O-CMC復凝止血海綿的止血時間和出血量分別為(26.96±3.80)s和(0.045±0.020)g;市售吸收性明膠海綿(陽性對照)的止血時間和出血量分別為(100.4±11.2)s和(0.15±0.03)g;醫用紗布(陰性對照)的止血時間和出血量分別為(218.2± 10.6)s和(2.57±0.54)g。O-CMC復凝止血海綿對創傷出血模型的止血時間和出血量顯著低于陽性對照組(n=4,P＜0.01)和陰性對照組(P＜0.01),說明自制O-CMC復凝止血海綿的止血效果良好。

2.3.2 止血可靠性觀察 待兔耳動、靜脈創傷出血模型使用止血材料完全止血后,除去砝碼,于30 min內繼續觀察其是否有續發性再出血現象(受試例數:5),結果O-CMC復凝止血海綿、市售吸收性明膠海綿和醫用紗布的30 min內再出血例數分別為0,2,5例。

由結果可知,兔耳動、靜脈創傷出血模型使用醫用紗布止血后,均出現再出血現象,說明醫用紗布只是壓迫止血,不能使創面主動形成凝血塊,當移走砝碼后,傷口再度破裂,導致出血;市售吸收性明膠海綿對于出血量較多的兔耳動脈血管的止血效果不理想,盡管可以形成凝血塊,但是由于動脈內血壓較高,容易沖破已經形成的凝血塊而發生再次出血現象。自制O-CMC復凝止血海綿對兔耳動、靜脈血管均具有較好的止血作用,無續發性再出血現象,止血效果可靠。據此得出如下結論:對于靜脈和較小的動脈出血,O-CMC復凝止血海綿和市售吸收性明膠海綿均有較好的止血效果,依次排序為:自制O-CMC復凝止血海綿≈市售吸收性明膠海綿＞醫用紗布;而對于較大的動脈出血,自制O-CMC復凝止血海綿比市售吸收性明膠海綿的止血效果更佳。

3 討論

采用冷凍干燥技術制得的O-CMC復凝止血海綿呈類白色,具有良好的韌性,疏松多孔,質地柔軟,浸泡后均勻膨脹;孔隙率為67.23%,吸水率為38.77%,密度為0.043 4 g·(cm3)-1,理化性質穩定,符合海綿劑的要求。

以自制O-CMC復凝止血海綿與市售吸收性明膠海綿進行止血效果的研究,結果發現,自制止血海綿與市售吸收性明膠海綿相比,其止血時間更短,出血量更少,且無續發性再出血現象。

自制O-CMC復凝止血海綿理化性質穩定,止血效果理想,使用、攜帶方便,作為一種新型創傷止血制劑值得進一步深入研究。

[1] 郭仕華,賀艷麗.殼聚糖在醫藥領域中的應用[J].食品與藥品,2005,7(8):1-4.

[2] 郭苗苗,徐丹,劉輝,等.水溶性O-羧甲基殼聚糖的制備及結構表征[J].中國藥師,2012,15(3):296-300.

[3] 董鵬飛.羧甲基殼聚糖在醫學領域中的應用進展[J].濱州醫學院學報,2009,32(6):445-447.

[4] 吳迪,劉輝,浦金輝,等.O-羧甲基殼聚糖抑菌作用研究[J].醫藥導報,2013,32(2):142-145.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.003

In vitro Characteristics and Hemostatic Effect of O-carboxymethyl Chitosan Multi-hemostatic Sponge

LIU Hui1,ZOU Qing-he2,WU Di1,3
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China;2.Department of Pharmacy,the First Hospital of Yidu City,Yidu 443300,China;3.Postgraduate 2010,College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo investigate the characteristicsin vitroand hemostatic function of O-carboxymethyl chitosan multi-hemostatic sponge.MethodsFreeze-drying technology was applied on preparation of O-carboxymethyl chitosan hemostatic sponge.The physicochemical properties of the self-produced multi-hemostatic sponge were observed for its appearance, porosity rate,water absorption,and density.The hemostatic effect was compared between the self-produced hemostatic sponge and commercially available absorbable gelatin sponge in rabbit models with ear venous and arterial injuries.ResultsThe selfproduced hemostatic sponge was off-white and full of pores with good tenacity and even net texture.Its porosity ratio,water absorption rate,and density were 67.23%,38.77%,and 0.043 4 g·(cm3)-1,respectively.The bleeding time volume were significantly lower fromthe self-produced sponge than that fromthe commercially available gelatin sponge.No secondary rebleeding was observed.ConclusionThe self-produced O-carboxymethyl chitosan multi-hemostatic sponge displays stable physicochemical characteristics and reliable hemostatic effect.

O-carboxymethyl chitosan;Multi-hemostatic sponge;Characteristicsin vitro;Hemostasis function

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0850-03

2013-07-17

2013-08-20

*武漢市科技攻關計劃(200960323135);全軍醫學科研“十二五”計劃課題(CWS11C27)

劉輝(1971-),男,湖北仙桃人,副主任藥師,博士,研究方向:藥物新劑型與新技術。電話:027-68879030,E-mail:pharmacyman@126.com。