活血消癭片對實驗性大鼠甲狀腺腫的影響*

田先翔,王瑞,泮劍英,吳勇,魯云,鄭國華

(湖北中醫藥大學藥學院,武漢 430065)

活血消癭片對實驗性大鼠甲狀腺腫的影響*

田先翔,王瑞,泮劍英,吳勇,魯云,鄭國華

(湖北中醫藥大學藥學院,武漢 430065)

目的 研究活血消癭片對實驗性大鼠甲狀腺腫模型的影響及其作用機制。方法將SD大鼠隨機分為6組:正常對照組,模型對照組,活血消癭片低、中、高劑量組,左甲狀腺素鈉組。除正常對照組外,其余各組大鼠連續灌服丙基硫氧嘧啶(20 mg·kg-1·d-1)造模。活血消癭片低、中、高劑量組同時灌服活血消癭片水溶液,劑量分別為4.4, 8.8,17.6 g·kg-1·d-1;左甲狀腺素鈉組灌服左甲狀腺素鈉片,7.8 μg·kg-1·d-1。60 d后測定大鼠甲狀腺、垂體的臟器指數以及血清中游離三碘甲狀腺氨酸原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)及促甲狀腺素(TSH)含量,甲狀腺、垂體做病理學檢查,免疫熒光法觀察其組織中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉化生長因子β(TGF-β)和B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因的表達。結果與模型對照組比較,活血消癭片低、中、高劑量組甲狀腺指數均明顯降低(P＜0.05),垂體指數無明顯改變(P＞0.05);FT3、FT4有升高趨勢,TSH有降低趨勢,但差異無統計學意義(P＞0.05);病理檢查結果顯示,與模型對照組比較,活血消癭片各劑量組甲狀腺形態結構有較大改善,腺體擴張,甲狀腺濾泡恢復呈中等大小,上皮細胞呈立方或扁平狀,濾泡腔內充滿豐富膠質,bFGF、Bcl-2陽性表達明顯降低(P＜0.01),TGF-β陽性表達明顯升高(P＜0.01)。結論活血消癭片具有較好的抗甲狀腺腫大作用,其機制可能與促進甲狀腺細胞凋亡、抑制甲狀腺細胞增殖有關。

活血消癭片;甲狀腺腫;藥效;免疫熒光

活血消癭方是湖北中醫藥大學附屬醫院名老中醫陳如泉教授治療結節性甲狀腺腫(nodular goiter,NG)的經驗方,該方以桃仁與莪術為主藥[1],對NG有肯定的臨床療效。臨床觀察表明,活血消癭片治療NG總有效率為87.9%[2],經活血消癭片治療的患者NG癥狀明顯緩解(甲狀腺腫大縮小,甚至消失),治療效果明確[3-4]。筆者在本實驗中觀察活血消癭片對實驗性甲狀腺腫大鼠的治療作用并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠,雄性,體質量120～150 g;雌性,體質量100～120 g。SPF級,共96只,雌雄各半。由湖北省實驗動物中心提供,動物合格證號:NO. 4200600507,動物生產許可證號:SCXK(鄂)2008-005,雌雄分籠飼養。

1.2 試藥 丙硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業有限公司,規格:每片50 mg,批號:101201),左甲狀腺素鈉片(商品名:優甲樂,德國默克雪蘭諾有限公司,批號: 133339,規格:每片50 μg);活血消癭片(湖北中醫藥大學附屬醫院制劑室提供,處方由土鱉蟲、蜈蚣、蜣螂蟲、桃仁、莪術、王不留行、貓爪草、柴胡等八味藥組成,規格:每片0.28 g,批準文號:鄂藥制字Z20113144,批號:20110314);游離三碘甲狀腺氨酸原氨酸(free triiodothyronine,FT3)測定試劑盒、游離甲狀腺素(free thyroxin,FT4)測定試劑盒、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)測定試劑盒(批號分別為006194,113033,114256,siemens Healthcare Diagnostics Inc);熒光一抗堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,GR24716-13,abcam);熒光一抗轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β,GR112432-2,abcam),熒光一抗抗B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma 2 gene,Bcl-2,GR118914-1, abcam);熒光二抗Bcl-2和bFGF為CY3標記的山羊抗兔、TGF-β為CY3標記的山羊抗小鼠(Jakson,批號: 109626,109626,110030);牛血清清蛋白(albumin frombovine serum,BSA,上海羅氏制藥有限公司,批號: 121E058,);4',6-二脒基-2-苯基吲哚抗熒光淬滅封片劑(diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI,上海碧云天生物技術有限公司,批號:0803021321, 0603141323)。

1.3 儀器 精密電子天平(FA2104N,上海菁海儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE TI-SR,日本尼康)。

1.4 動物造模與給藥 大鼠適應性飼養1周后,按體質量分層隨機分為6組[5],即正常對照組,模型對照組,活血消癭片低、中、高劑量組,左甲狀腺素鈉組。參考文獻[6-7]方法,結合本實驗室預實驗結果對大鼠進行處理。正常對照組大鼠每天灌胃給予0.9%氯化鈉溶液2 mL·kg-1,其余各組大鼠每天灌胃給予丙硫氧嘧啶20 mg·kg-1造甲狀腺腫模型[將丙硫氧嘧啶用0.9%氯化鈉溶液配制成2 mg·mL-1水溶液,灌胃劑量為1 mL·(100 g)-1]。活血消癭片低、中、高劑量組同時分別灌服活血消癭片水溶液(將活血消癭片用0.9%氯化鈉溶液分別配制成4.4,8.8,17.6 g·mL-1水溶液,每日灌胃劑量為1 mL·kg-1)4.4,8.8,17.6 g·kg-1·d-1;左甲狀腺素鈉組大鼠同時灌以左甲狀腺素鈉片[8](將左甲狀腺素鈉用0.9%氯化鈉溶液分別配制成7.8 μg·mL-1溶液,每日灌胃劑量為1 mL·kg-1),7.8 μg·kg-1·d-1,連續60 d。末次給藥前1 d禁食不禁水。末次給藥后1 h頸總動脈取血處死動物,留取血清和相關組織備檢。

1.5 指標檢測

1.5.1 臟器指數 迅速鈍性剝離甲狀腺組織和垂體,濾紙吸盡液體,精密稱質量,計算臟器指數(臟器指數=臟器質量/體質量)。

1.5.2 血清FT3、FT4、TSH測定 采用化學發光法,照說明書進行。

1.5.3 病理檢查 甲狀腺組織和垂體用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,脫蠟染色后脫水封固。

1.5.4 甲狀腺組織bFGF、Bcl-2和TGF-β的表達 按常規進行免疫熒光制片,4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)顯色。組織切片做完免疫熒光后用抗熒光淬滅封片劑封片,然后于倒置熒光顯微鏡下觀察攝影。各組中每張切片隨機挑選至少3個200倍視野進行攝影。應用Image-ProPlus16.0對照片進行分析,得出其陽性累積吸光度值。

2 結果

2.1 活血消癭片對大鼠甲狀腺、垂體組織質量的影響結果見表1。與正常對照組比較,模型對照組甲狀腺指數明顯增大,表明甲狀腺腫模型造模成功;與模型對照組比較,活血消癭片低、中、高劑量組大鼠甲狀腺指數均顯著降低,垂體指數均差異無統計學意義,提示活血消癭片可明顯縮小腫大的甲狀腺。

2.2 活血消癭片對大鼠血清FT3、FT4、TSH的影響結果見表2。與正常對照組比較,模型對照組FT3、FT4明顯降低,TSH明顯升高,表明模型成功。與模型對照組相比,活血消癭片低、中、高劑量組FT3、FT4均有升高趨勢,TSH均有降低趨勢,但差異無統計學意義。左甲狀腺素鈉組FT3、FT4明顯升高,TSH明顯降低。結果顯示,活血消癭片對甲狀腺激素影響不明顯。

2.3 活血消癭片對大鼠甲狀腺組織的影響 肉眼觀察可見,正常對照組大鼠甲狀腺呈淡紅色扁平狀,難見到峽部,模型對照組大鼠甲狀腺明顯充血腫大,為絳紫色梭錘狀,質較堅硬,峽部明顯可見,易與其他組織剝離開來。活血消癭片各劑量組顏色較模型對照組淺,質地較軟。

蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色(圖1)可見,正常對照組甲狀腺內有大量圓形或橢圓形甲狀腺濾泡,濾泡壁由單層上皮圍成,形成雙層壁,上皮細胞呈矮立方形。少量的間質,濾泡腔內含有淡紅色膠狀物,內含吸收空泡。模型對照組甲狀腺濾泡增生,與正常對照組相比甲狀腺濾泡上皮高度明顯較高,甲狀上皮細胞肥大增生,細胞由扁平變為立方形,部分呈柱狀,腔內膠質少。活血消癭片低、中、高劑量組甲狀腺形態結構較模型對照組有較大改善,甲狀腺濾泡恢復呈中等大小,上皮細胞呈立方或扁平狀,濾泡腔內充滿豐富的膠質。

表1 6組大鼠甲狀腺及垂體質量與臟器指數測定結果Tab.1 Results of weight and organ index of thyroid and pituitary in six groups of rats ±s

表1 6組大鼠甲狀腺及垂體質量與臟器指數測定結果Tab.1 Results of weight and organ index of thyroid and pituitary in six groups of rats ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;compared with model control group,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (g·kg-1)甲狀腺質量垂體質量mg甲狀腺指數垂體指數(×10-6)正常對照組16…28.58±0.1822.27±0.31124.10±27.7993.43±51.68模型對照組160.02137.91±1.3819.26±0.19677.35±164.14*194.35±44.20活血消癭片低劑量組164.4136.88±0.4715.95±0.01581.48±106.34*269.18±18.30中劑量組168.8128.26±2.2518.74±0.01522.99±21.53*2112.26±16.88高劑量組1617.6133.22±2.4520.55±0.19552.31±21.37*286.47±35.24左甲狀腺素鈉組160.02159.41±0.9424.91±0.28582.73±50.42*287.24±25.27

表2 6組大鼠血清FT3、FT4、TSH含量測定結果Tab.2 Determination results of the serumlevels of FT3,FT4and TSH in six groups of rats ±s

表2 6組大鼠血清FT3、FT4、TSH含量測定結果Tab.2 Determination results of the serumlevels of FT3,FT4and TSH in six groups of rats ±s

與正常組比較,*1P＜0.05;與模型對照組比較,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.05;compared with model control group,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (g·kg1) FT3FT4(pg·mL-1) TSH/ (μU·mL-1)正常對照組16…2.04±0.1719.1±0.90.01±0.01模型對照組160.020.44±0.07*11.3±0.3*10.31±0.03*1活血消癭片低劑量組164.40.62±0.061.5±0.10.21±0.03中劑量組168.80.51±0.081.6±0.10.19±0.02高劑量組1617.60.62±0.051.6±0.10.19±0.02左甲狀腺素鈉組160.021.19±0.04*221.0±0.3*20.10±0.01*2

2.4 活血消癭片對丙基硫氧嘧啶致大鼠甲狀腺腫模型甲狀腺Bcl-2、bFGF及TGF-β表達的影響 見表3。與正常對照組比較,模型對照組Bcl-2、bFGF表達明顯增高,TGF-β表達明顯降低;與模型對照組比較,活血消癭片低、中、高劑量組和左甲狀腺素鈉組Bcl-2、bFGF表達明顯降低,TGF-β表達明顯升高(圖2～4)。

3 討論

筆者在本研究中采用的丙硫氧嘧啶致大鼠甲狀腺肥大是一種經典的甲狀腺腫模型,丙硫氧嘧啶通過抑制過氧化物酶,減少碘的氧化和酪氨酸碘化及碘化酪氨酸縮合而抑制甲狀腺激素的合成。另外,丙硫氧嘧啶還能抑制T4轉變為T3,致使血清之中較強活性的T3含量明顯快速降低。由于T3、T4水平降低,通過負反饋調節作用,促進垂體分泌TSH,從而導致甲狀腺增生肥大——這種模型與人類甲狀腺結節有一定的區別。本實驗結果表明,活血消癭片能夠降低模型大鼠甲狀腺指數,具有一定的消腫作用。活血消癭片雖然有升高FT3、FT4,降低TSH的作用趨勢,但差異無統計學意義,說明活血消癭片對甲狀腺激素生成與降解的影響較小,其縮小甲狀腺的作用與促進FT3、FT4合成可能無關,其治療NG時不影響甲狀腺生理功能是其優點。

表3 6組大鼠Bcl-2、bFGF與TGF-β測定結果Tab.3 Determination results of Bcl-2、bFGF and TGF-β in six groups of rats ±s

表3 6組大鼠Bcl-2、bFGF與TGF-β測定結果Tab.3 Determination results of Bcl-2、bFGF and TGF-β in six groups of rats ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;compared with model control group,*2P＜0.01

組別Bcl-2bFGFTGF-β正常對照組108±3306 941±810模型對照組59 795±901*11 456±127*1269±161*1活血消癭片低劑量組2 259±418*2325±181*21 608±298*2中劑量組2 086±184*2239±64*21 864±215*2高劑量組1 924±259*2219±87*22 053±367*2左甲狀腺素鈉組1 579±50*2200±49*22 100±335*2

A.正常對照組;B.模型對照組;C.活血消癭片低劑量組;D.活血消癭片中劑量組;E.活血消癭片高劑量組;F.左甲狀腺素鈉組圖1 6組大鼠甲狀腺組織病理檢查結果(HE,×100)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.1 Pathological results of thyroid in six groups of rats(HE,×100)

A.正常對照組;B.模型對照組;C.活血消癭片低劑量組;D.活血消癭片中劑量組;E.活血消癭片高劑量組;F.左甲狀腺素鈉組圖2 6組大鼠甲狀腺組織Bcl-2表達結果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.2 Bcl-2 expression of thyroid in six groups of rats(×200)

A.正常對照組;B.模型對照組;C.活血消癭片低劑量組;D.活血消癭片中劑量組;E.活血消癭片高劑量組;F.左甲狀腺素鈉組圖3 6組大鼠甲狀腺組織bFGF表達結果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.3 bFGF expression of thyroid in six groups of rats(×200)

A.正常對照組;B.模型對照組;C.活血消癭片低劑量組;D.活血消癭片中劑量組;E.活血消癭片高劑量組;F.左甲狀腺素鈉組圖4 6組大鼠甲狀腺組織TGF-β表達結果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.low-dose huoxuexiaoying tablet group;D.medium-dose huoxuexiaoying tablet group;E.high-dose huoxuexiaoying tablet group;F.euthyrox groupFig.4 TGF-β expression of thyroid in six groups of rats(×200)

bFGF為含155個氨基酸的陽離子多肽,是重要的促有絲分裂因子,也是形態發生和分化的誘導因子,其生理作用包括促進創傷愈合與組織修復、促進組織再生等,是促進細胞生長的調控因子之一,通過與靶細胞上的受體結合而發揮作用,能夠刺激甲狀腺濾泡細胞不斷增生及分化。Bcl-2是調控細胞凋亡的主要因子之一,通過調節其與細胞中bax蛋白質結合構成不同的二聚體比例來抑制細胞凋亡,延長細胞生存期,促進細胞增殖[9]。TGF-β在炎癥、組織修復和胚胎發育方面具有重要的生理功能,對細胞的生長、分化和免疫功能也有重要的調節作用。其機制與促進細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)如膠原蛋白、纖粘連蛋白的表達和抑制ECM的降解,對細胞的形態發生、增殖和分化過程起著重要作用。在甲狀腺腫主要通過甲狀腺濾泡上皮細胞增生,能夠抑制其增殖并維持甲狀腺濾泡上皮細胞的正常形態[10]。實驗結果顯示,活血消癭片可以使甲狀腺腫大大鼠的bFGF及Bcl-2表達明顯降低,TGF-β表達升高,說明活血消癭片抗甲狀腺腫的作用可能與抑制甲狀腺組織的增生、促進其分化有關。其完整作用的機制有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.004

Effects of Huoxuexiaoying Tablet on the Goiter Model of Rats

TIAN Xian-xiang,WANG Rui,PAN Jian-ying,WU Yong,LU Yun,ZHENG Guo-hua
(College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo investigate the effects and mechanismofhuoxuexiaoyingtablet on experimental goiter of rats.MethodsThe rats were randomly divided into six groups:the control,the model control group,huoxuexiaoyingtablet at different doses,and the sodiumlevothyroxine group(Euthyrox group).Except for the rats in the control,the rats in other groups were given with propylthiouracil(20 mg·kg-1·d-1)by intragastric(i.g.)administration every day for 60 days.Meanwhile, some rats were treated withhuoxuexiaoyingtablet at low(4.4 g·kg-1·d-1),middle(8.8 g·kg-1·d-1)and high dose(17. 6 g·kg-1·d-1)orally,and those in the Euthyrox group were given with 7.8 μg·kg-1·d-1Euthyrox by i.g.administration.The rats in the control group were administrated with the same volume of saline(N.S).After 60 days of treatment,the rats were sacrificed,the organ indexes of thyroid and pituitary and the levels of free triiodothyronine(FT3)、free thyroxin(FT4)and thyroid stimulating hormone(TSH)in serum,were tested.The expression of basic fibroblast growth factor(bFGF),transforming growth factor-β(TGF-β)and B-cell lymphoma 2 gene(Bcl-2)were examined by immunofluorescence.ResultsCompared with the model,organ indexes of thyroid were significantly reduced byhuoxuexiaoyingtablet at three doses(P＜0.05),but not for the pituitary(P＞0.05).The levels of FT3and FT4were in a elevating trend,but TSH decreased with no significance(P＞0.05).The morphological structure of thyroid was greatly improved byhuoxuexiaoyingtablet in comparison with the model.In which the gland dilated,thyroid follicular restored to moderate size,epithelia were cubic or flattened and follicular cavity filled with abundant glial.The expression of bFGF and Bcl-2 decreased significantly(P＜0.01)while TGF-β expression increased notably(P＜0.01).ConclusionHuoxuexiaoyingtablet has a great anti-goiter effect,the mechanismof which may be related to promoting thyroid cells apoptosis and inhibiting thyroid cells proliferation.

Huoxuexiaoyingtablet;Goiter;Pharmacodynamics;Immunofluorescence

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0853-05

2013-09-02

2013-10-10

*2010年湖北省教育廳重點項目(D20101804)

田先翔(1971-),男,湖北仙桃人,副教授,碩士生導師,博士,主要從事中藥藥理學研究。電話:027-68890137,E-mail:doctortxx@aliyun.com。

鄭國華(1964-),男,天津人,教授,博士生導師,博士,主要從事中藥新制劑與新劑型的研究。電話:027-68890113,E-mail:zgh1227@sina.com。