菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性篩選*

羅艷琴,馬云,宋路瑤,秦飛,范銀洲,侯連兵

(1.南方醫科大學南方醫院藥學部,廣州 510515;2.南方醫科大學藥學院,廣州 510515)

菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性篩選*

羅艷琴1,馬云1,宋路瑤1,秦飛1,范銀洲2,侯連兵1

(1.南方醫科大學南方醫院藥學部,廣州 510515;2.南方醫科大學藥學院,廣州 510515)

目的 研究菝葜不同濃度乙醇提取物治療小鼠耳腫脹模型和大鼠棉球肉芽腫模型的藥理作用,為確定菝葜最佳提取工藝提供參考。方法采用不同濃度乙醇制備菝葜提取物,觀察其對二甲苯致小鼠耳腫脹模型和大鼠棉球肉芽增生的影響。結果與模型對照組比較,高、中、低劑量菝葜70%乙醇提取物對小鼠耳腫脹度有顯著的抑制作用(t=2.58,P＜0.05;t=2.28,P＜0.05;t=2.17,P＜0.05),可明顯降低大鼠棉球肉芽腫增生(t=5.28,P＜0.01;t=5.24,P＜0.01;t=5.17,P＜0.01)。結論小鼠耳腫脹和大鼠棉球肉芽腫兩種模型證實,菝葜70%乙醇提取物各劑量組的抗炎活性作用最好。

菝葜;乙醇提取物;腫脹,耳;肉芽腫

菝葜又名金剛藤,為百合科植物菝葜(Smilax china L.)的干燥根莖,其味酸、甘,性平,具有祛風利濕、解毒散瘀的功效[1]。研究發現,菝葜具有抗炎鎮痛、活血化瘀、免疫抑制、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[2]。目前對菝葜提取物抗炎作用的報道多見于菝葜水煎液[3],菝葜50%,80%乙醇提取物[4],以及菝葜95%乙醇提取物[5]的抗炎藥理作用,常采用水提醇沉法[6]。而且對菝葜不同濃度乙醇提取物的最佳提取工藝的篩選研究多停留在正交設計含量測定階段[7-9],筆者未見菝葜不同濃度乙醇提取物抗炎療效的藥效學比較研究。筆者在本研究中通過比較菝葜不同濃度乙醇回流提取物對小鼠耳腫脹模型和大鼠棉球肉芽腫模型的抗炎作用實驗,以期從抗炎藥效角度確立菝葜在現代中藥制劑中的最佳提取乙醇濃度,為進一步研究菝葜提取、分離、純化工藝提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specefic pathogen free, SPF)級斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠170只,雌性,體質量180～220 g,由南方醫科大學實驗動物中心提供,生產許可證號:SCXK(粵)2011-0015,合格證號:No.4402101912。SPF級昆明小鼠255只,雌性,體質量18～22 g,由南方醫科大學實驗動物中心提供,生產許可證號:SCXK(粵)2011-0015,合格證號: No.44002100000209。實驗前將動物置室內適應性飼養3 d,室溫18～22℃,相對濕度50%～70%。

1.2 藥物與試劑 菝葜由湖北省藥材公司提供,經南方醫科大學中醫藥學院劉傳明教授鑒定為百合科植物菝葜的根莖。金剛藤膠囊(湖北福人藥業股份有限公司,批號:20110318)。二甲苯(廣東光華科技股份有限公司,批號:20111225),戊巴比妥鈉(Merck公司,批號:1212013),注射用頭孢美唑鈉(DAEWOONG公司,批號:064065)。

1.3 儀器 KH-500B超聲波清洗器(昆山禾木創超聲儀器有限公司),升降恒溫水油浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司),RE旋轉蒸發器(鞏義市予華儀器有限責任公司),D2F-6050真空干燥箱(鞏義市英峪予華儀器廠),HH-S6數顯恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠),YP10002型電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司),BA110S型電子分析天平(萬分之一精確度,德國Sartorius),微量加樣器(Eppendorf公司),GZX-DH電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫療器械廠)。

1.4 菝葜不同濃度乙醇提取物受試藥物的制備

1.4.1 菝葜水提取物 取菝葜藥材,粉碎后過篩孔內徑0.15 mm篩(100目)備用,稱取粗粉1 000 g,加8倍量水提取2 h,5倍量水提取2 h,5倍量水再提取1 h,合并濾液,靜置過夜,濾過,50～60℃減壓濃縮得浸膏,每克浸膏相當于原藥材21.22 g。

1.4.2 菝葜30%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,30%乙醇用量為8,5,5倍,提取時間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無醇味,得浸膏,每克浸膏相當于原藥材50.46 g。

1.4.3 菝葜50%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,50%乙醇用量為8,5,5倍,提取時間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無醇味,得浸膏,每克浸膏相當于原藥材51.38 g。

1.4.4 菝葜70%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,70%乙醇用量為8,5,5倍,提取時間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無醇味,得浸膏,每克浸膏相當于原藥材51.56 g。

1.4.5 菝葜95%乙醇提取物 稱取菝葜粉碎備用粗粉1 000 g,95%乙醇用量為8,5,5倍,提取時間為2, 2,1 h。合并3次濾液,50～60℃減壓濃縮至無醇味,得浸膏,每克浸膏相當于原藥材50.84 g。

1.5 二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型實驗

1.5.1 模型的制備 取雌性昆明小鼠,連續給藥3 d,于第4天灌胃給藥30 min后,以移液槍將二甲苯涂于小鼠右耳前后兩面各0.015 mL,每鼠右耳共0.03 mL;左耳做空白對照。20 min后處死小鼠,從耳廓基部剪下雙耳,并以直徑8 mm打孔器分別沿左右耳緣正中相同部位等面積打下兩圓形耳片,稱質量[10]。

1.5.2 分組及給藥 將255只雌性昆明小鼠采用完全隨機分組方法分為17組:菝葜水提取物,30%, 50%,70%,95%乙醇提取物的高、中、低劑量組均分別灌胃給予46.8,23.4,11.7 g·kg-1藥物(按生藥量計,即相當于臨床等效劑量的4,2,1倍);金剛藤膠囊組以生藥量計23.4 g·kg-1,灌胃給予小鼠,相當于臨床用量的2倍;模型對照組給予等體積純化水。每天1次,連續給藥3 d。

1.5.3 觀察指標 用電子天平(精確度為萬分之一)準確稱左、右耳朵片質量,計算耳腫脹度;小鼠處死后,腹部正中切開,立即摘取脾臟稱質量,計算臟器指數。計算公式:耳腫脹度=右耳朵片質量-左耳朵片質量;脾臟指數(%)=(脾臟質量/小鼠體質量)×100%。

1.6 大鼠棉球肉芽腫模型實驗

1.6.1 模型的制備 取SD雌性大鼠,禁食不禁水12 h,3%戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)腹腔麻醉,剪除其下腹中部毛,以酒精消毒,在腹部正中切開1 cm開口,從切口向左側腹股溝塞入滅菌棉球1個[棉球質量(50±1)mg,臨用前用注射器注入1 mg·(0.1 mL)-1頭孢美唑鈉],縫合腹壁皮膚,安爾碘皮膚消毒劑消毒術區[11]。

1.6.2 分組及給藥 將清醒后的雌性SD大鼠隨機分為17組:菝葜水提取物,30%,50%,70%,95%乙醇提取物的高、中、低劑量組均分別灌胃給予32.4,16. 2,8.1 g·kg-1藥物(按生藥量計,即相當于臨床等效劑量的4,2,1倍);金剛藤膠囊組以生藥量計16.2 g·kg-1灌胃給藥(相當于臨床等效劑量的2倍);模型對照組給予等體積純化水。每天1次,連續給藥7 d。

1.6.3 觀察指標 于給藥后第8天,3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,從原切口將棉球連同周圍增生的結締組織一起取出,剔除脂肪組織,恒溫干燥箱60℃放置24 h后,用電子天平精密稱質量,減去棉球原質量即得肉芽腫質量。因動物攝食量的降低或體質量減輕亦可降低肉芽腫質量,故應按mg(肉芽腫)·(100 g)-1(體質量)表示[12]。計算公式:肉芽腫凈質量=(棉球肉芽腫質量-植入棉球質量)/7 d后大鼠的體質量;肉芽腫抑制率(%)=(模型對照組肉芽腫平均凈質量-給藥組肉芽腫平均凈質量)/模型對照組肉芽腫平均凈質量×100%。

1.7 統計學方法 所有數據均采用SPSS16.0版軟件進行統計。計量資料統計結果用均數±標準差(±s)表示,完全隨機設計資料的多個樣本均數比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較,方差齊時采用LSD檢驗,方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型實驗結果 以二甲苯涂抹小鼠右耳正、反面20 min后,小鼠右耳充血腫脹明顯。由表1可知,與模型對照組比較,金剛藤膠囊組小鼠耳腫脹程度顯著改善(t=2.05,P＜0.05);70%乙醇提取物高劑量組(t=2.58,P＜0.05),中劑量組(t=2.28, P＜0.05),低劑量組(t=2.17,P＜0.05)小鼠耳腫脹被明顯抑制;菝葜水提取物高劑量組(t=-0.35,P＞0.05)、中劑量組(t=-0.13,P＞0.05)、低劑量組(t=-0.32,P＞0.05),30%乙醇提取物的高劑量組(t=1.37,P＞0.05)、中劑量組(t=0.60,P＞0.05)、低劑量組(t=0.24,P＞0.05),50%乙醇提取物的高劑量組(t=1.67,P＞0.05)、中劑量組(t=1.27,P＞0.05)、低劑量組(t=1.01,P＞0.05),95%乙醇提取物的高劑量組(t=1.52,P＞0.05)、中劑量組(t=1.60,P＞0.05)、低劑量組(t=1.49,P＞0.05)小鼠耳腫脹均未被明顯抑制。提示菝葜70%乙醇提取物抗炎活性作用最好。

肉眼觀察發現,模型對照組小鼠脾臟明顯腫大。與模型對照組比較,金剛藤膠囊組(t=1.99,P＜0.05),30%乙醇提取物高劑量組(t=2.56,P＜0.05)、中劑量組(t=2.08,P＜0.05),50%乙醇提取物中劑量組(t=2.56,P＜0.05)、低劑量組(t=2.07,P＜0.05)和95%乙醇提取物低劑量組(t=2.49,P＜0.05)脾臟腫大均減少;50%乙醇提取物高劑量組(t=3.11,P＜0.01),70%乙醇提取物高劑量組(t=4.33,P＜0.01)、中劑量組(t=4.23,P＜0.01)、低劑量組(t=3.55,P＜0.01),95%乙醇提取物高劑量組(t=3.59,P＜0.01)、中劑量組(t=2.76,P＜0.01)脾臟腫大差異有統計意義;菝葜水提取物高劑量組(t=0.07,P＞0.05)、中劑量組(t=-0.15,P＞0.05)、低劑量組(t=-0.51,P＞0.05)和30%乙醇提取物低劑量組(t=1.53,P＞0.05)脾臟腫大被抑制不明顯,差異無統計學意義。見表1。

2.2 大鼠棉球肉芽腫實驗研究 與模型對照組比較,金剛藤膠囊組大鼠棉球肉芽腫增生(t=5.59,P＜0.01)明顯降低,而30%,50%,70%,95%乙醇提取物高、中、低劑量組大鼠棉球肉芽腫增生均被不同程度抑制,其中30%乙醇提取物的高劑量組(t=2.61,P＜0.05)、中劑量組(t=2.65,P＜0.05)、低劑量組(t=2.44,P＜0.05)及95%乙醇提取物低劑量組(t=2.4,P＜0.05)差異有統計學意義;50%乙醇提取物的高劑量組(t=4.22,P＜0.01)、中劑量組(t=4.1,P＜0.01)、低劑量組(t=3.91,P＜0.01),70%乙醇提取物的高劑量組(t=5.28,P＜0.01)、中劑量組(t=5.24,P＜0.01)、低劑量組(t=5.17,P＜0.01)差異有統計學意義,95%乙醇提取物的高劑量組(t=2.89,P＜0.01)、中劑量組(t= 3.17,P＜0.01)差異有統計學意義;70%乙醇提取物各劑量組療效均優于50%乙醇提取物各劑量組。說明70%乙醇提取物各劑量組對大鼠棉球肉芽腫增生的抑制作用最優。菝葜水提取物高劑量組(t=1.45,P＞0.05)、中劑量組(t=0.62,P＞0.05)、低劑量組(t= 0.04,P＞0.05)差異無統計學意義,見表2。

表1 菝葜不同溶劑提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹及脾臟指數的影響Tab.1 Effect of different solvent extracts of Smilax China on xylene-induced ear edema and spleen index in mice ±s

表1 菝葜不同溶劑提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹及脾臟指數的影響Tab.1 Effect of different solvent extracts of Smilax China on xylene-induced ear edema and spleen index in mice ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別數量/只劑量/(g·kg-1)耳腫脹度/mg脾臟指數/%模型對照組15…5.98±3.820.40±0.12金剛藤膠囊組1523.43.62±2.66*10.34±0.07*1菝葜水提取物高劑量組1446.86.39±4.480.40±0.08中劑量組1323.46.14±3.140.40±0.08低劑量組1411.76.35±3.220.41±0.09菝葜30%乙醇提取物高劑量組1546.84.41±3.180.32±0.09*1中劑量組1523.45.29±3.750.34±0.06*1低劑量組1411.75.70±3.700.35±0.12菝葜50%乙醇提取物高劑量組1546.84.05±3.110.30±0.08*2中劑量組1423.44.49±2.920.32±0.05*1低劑量組1511.74.81±2.650.34±0.06*1菝葜70%乙醇提取物高劑量組1546.83.01±2.23*10.27±0.08*2中劑量組1523.43.35±2.77*10.27±0.05*2低劑量組1511.73.48±2.39*10.29±0.09*2菝葜95%乙醇提取物高劑量組1346.84.16±3.220.29±0.07*2中劑量組1523.44.13±3.220.31±0.09*2低劑量組1511.74.26±2.440.32±0.06*1

3 討論

炎癥通常可依病程經過分為急性炎癥和慢性炎癥。急性炎癥起病急驟,持續時間短,僅幾天到一個月,以滲出病變為其特征,炎癥細胞浸潤以粒細胞為主。慢性炎癥持續時間較長,常數月到數年,以增生、病變為主,其炎癥細胞浸潤則以巨噬細胞和淋巴細胞為主[13]。小鼠耳腫脹模型是急性炎癥模型的一種,常用二甲苯作為致炎劑來誘導小鼠耳腫脹,二甲苯局部刺激作用導致毛細血管通透性增高及滲出腫脹,引起急性炎癥。近幾年來,小鼠耳腫脹模型已發展成為一類比較成熟的動物炎癥模型,由于其操作簡單,模型穩定,常用來評價一些植物有效成分的抗炎活性[14]。大鼠棉球肉芽腫屬慢性炎癥模型,棉球肉芽腫病變以棉球為中心,周圍有多量巨噬細胞、異物巨細胞、成纖維細胞和淋巴細胞等包繞,形成結節狀病灶,引起慢性炎癥。建立急性和慢性炎癥兩種經典動物模型,是研究菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性篩選的重要途徑。

本實驗比較了菝葜不同濃度乙醇提取物的抗炎活性作用。發現菝葜乙醇提取物在抑制小鼠耳腫脹度和大鼠棉球肉芽腫增生的炎癥方面具有一定作用,表明菝葜制劑用于抗炎具備較好的藥理學基礎。對菝葜不同濃度乙醇提取物藥理作用結果進行對比分析顯示:在對抗小鼠耳朵腫脹和大鼠棉球肉芽腫增生方面,均以菝葜70%乙醇提取物的抗炎作用更為明顯,這一結果可為后期繼續研究不同極性有機溶劑對菝葜提取物的分離、純化工藝提供藥理學參考依據。同時,為適應中藥現代化菝葜有效部位制劑的二次開發提供科學依據。

表2 菝葜不同溶劑提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響Tab.2 Effect of different solvent extracts of Smilax China on cotton ball-induced granuloma in rats ±s

表2 菝葜不同溶劑提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響Tab.2 Effect of different solvent extracts of Smilax China on cotton ball-induced granuloma in rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別數量/只劑量/ (g·kg-1) 24 h干燥后肉芽腫凈質量/[mg·(100 g)-1]肉芽腫抑制率/ %模型對照組11純化水52.39±7.83*1…金剛藤膠囊組1116.233.85±4.21*135.50菝葜水提取物高劑量組1032.447.47±8.819.54中劑量組1016.250.27±8.434.01低劑量組108.152.27±7.190.19菝葜30%乙醇提取物高劑量組1032.443.52±8.50*216.98中劑量組1016.243.40±9.06*217.18低劑量組108.144.09±8.52*215.84菝葜50%乙醇提取物高劑量組1032.438.03±7.61*127.48中劑量組1016.238.45±8.31*126.53低劑量組108.139.08±6.77*125.38菝葜70%乙醇提取物高劑量組1032.434.46±6.23*134.16中劑量組1116.235.01±7.60*133.21低劑量組118.135.23±6.25*132.82菝葜95%乙醇提取物高劑量組832.441.94±11.47*120.04中劑量組1116.241.86±7.25*120.04低劑量組118.144.43±7.40*215.27

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.005

Screening of the Different Concentrations of Ethanol Extracts fromSmilax China for Its Antiinflammatory Activity

LUO Yan-qin1,MA Yun1,SONG Lu-yao1,QIN Fei1,FAN Yin-zhou2,HOU Lian-bing1
(1.Department of Pharmacy,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.School of Pharmacy, Southern Medical University,Guangzhou 510515,China)

ObjectiveTo study the effects of the different concentrations of ethanol extracts ofSmilax Chinaon ear edema in mice and granuloma in rats,and to provide an evidence for optimizing the extraction process.MethodsEffects of different concentrations of ethanol extracts ofSmilax Chinaon the xylene-induced ear edema in mice and the cotton ball-induced granuloma hyperplasia in rats were tested.ResultsCompared with the model controls,70%ethanol extracts ofSmilax Chinaat high,mediumand lowdoses significantly inhibited ear edema in mice(t=2.58,P＜0.05;t=2.28,P＜0.05;t=2.17,P＜0.05) and reduced the granuloma hyperplasia in rats(t=5.28,P＜0.01;t=5.24,P＜0.01;t=5.17,P＜0.01).ConclusionThe 70%ethanol extracts ofSmilax Chinaat three doses present the most active antiinflammatory effect,confirmed in both mice ear edema and rats granuloma models.

Smilax China;Ethanol extracts;Edema,ear;Granuloma

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)07-0858-05

2013-07-22

2013-08-25

*廣東省醫院藥學研究基金(奧賽康基金) (2014A14)

羅艷琴(1988-),女,江西南昌人,在讀碩士,主要研究方向:中藥藥理與藥劑。E-mail:lyq20080831@163.com。

侯連兵(1957-),男,湖南株洲人,博士生導師,主任藥師,主要研究方向:藥物設計與藥理學評價。電話:020-61642175,E-mail:hlianbing@163.com。