連杖微乳的制備工藝

林麗,銀杉杉,劉磐,朱莉,陳威,林吉,張軍

(1.廣州中醫藥大學新藥開發研究中心,廣州 510006;2.廣東藥學院,廣州 510006;3.廣州醫藥研究總院有限公司,廣州 510240)

連杖微乳的制備工藝

林麗1,銀杉杉1,劉磐1,朱莉2,陳威3,林吉1,張軍1

(1.廣州中醫藥大學新藥開發研究中心,廣州 510006;2.廣東藥學院,廣州 510006;3.廣州醫藥研究總院有限公司,廣州 510240)

目的 制備含茶油連杖微乳,并對其質量進行初步評價。方法采用滴定法繪制偽三元相圖優選處方,以單因素實驗優選工藝參數,并初步考察微乳的理化特性。結果微乳處方為:黃連提取物∶虎杖提取物∶茶油∶聚氧乙烯-35-蓖麻油∶丙二醇∶水的質量比為1∶1.4∶1∶7∶7∶21,75℃條件下,1 400 r·min-1攪拌20 min,微乳平均粒徑為30.9 nm,粒徑分布均勻,經高低溫實驗及加速實驗仍然澄清透明,未出現相分離、沉淀和渾濁等現象。結論連杖微乳制備工藝簡單,性質穩定。

連杖微乳;制備工藝;質量評價

中藥燒燙傷制劑多為油劑,極性較大的有效成分難溶于油中,導致其中有效成分含量較低,無法滿足臨床需要。微乳作為新型藥物載體,是一種熱力學和動力學均較穩定的分散體系,粒徑小(10～100 nm),對水溶性、脂溶性及難溶性藥物均有較好的溶解能力,近幾年來在藥學上應用越來越廣泛[1-2]。連杖復方由黃連、虎杖、茶油等組成。黃連中的鹽酸小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、黃連堿有抑制金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、真菌等藥理作用,保證了創面的再修復[3-4]。虎杖中的二苯乙烯類物質如白藜蘆醇及虎杖苷具有抗菌、抗氧化、抗休克、抗血小板凝聚、改善微循環等作用[5-6]。茶油有清熱解毒、除腐生肌、抗炎止癢、護膚養顏的功效[7]及抗氧化、抗菌、促進組織修復等作用[8]。由于茶油等植物油的乳化困難,含有茶油等植物油的中藥復方微乳體系鮮見報道。筆者采用微乳技術,構建含有黃連、虎杖醇提物及茶油的微乳體系,并對其穩定性、粒徑進行考察,以期為開發安全、有效、使用方便的燒燙傷制劑奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀(UV檢測器,LC-20AT泵,SIL-20A自動進樣器,Labsolution色譜工作站);78-1型恒溫磁力攪拌器(上海喬躍電子有限公司);高速離心機離心機(型號HC-3018,安徽中科中佳科學儀器有限公司);1000 HSA激光粒度儀(英國馬爾文公司);萬分之一分析天平(Mettler Toledo CP225D);十萬分之一分析天平(Mettler Toledo AB204-N);旋轉蒸發儀(EYELA SB-1000);KQ5200DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲設備有限公司)。

1.2 試藥 聚乙二醇硬脂酸酯15(HS15,批號: 16087036W0),聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40,批號: 79062488Q0),PEG-60氫化蓖麻油(RH60,批號: 43057368R0)均為德國巴斯夫股份有限公司;茶油(江西恩泉油脂有限公司,藥用級,批號:101123);曲拉通X-100(OP,批號:38632)、聚氧乙烯-35-蓖麻油(EL-35,批號:J1218047)為阿拉丁試劑上海有限公司提供;聚山梨酯80(TW80)、1,2-丙二醇、聚乙二醇400 (PEG400)、丙三醇均為天津市大茂化學試劑廠;黃連提取物(75%乙醇提取物)、虎杖提取物(80%乙醇提取物),均為自制;鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110713-200911,規格:20 mg);虎杖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111575-200502,規格:20 mg);色譜甲醇、乙腈(Merck),水為自制超純水,其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 處方的確定

2.1.1 不同溶劑對鹽酸小檗堿和虎杖苷的溶解能力考察 在溫度25℃條件下,將足量黃連提取物及虎杖提取物分別加入含有適量溶媒的試管中,并分別加入乳化劑(EL-35、RH-40、RH-60、HS15、TW80、OP)和助乳化劑(PEG400、1,2-丙二醇、丙三醇)。密封后將試管于渦旋混合器上渦旋20 min,使藥物充分溶解。取出,微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過,取續濾液適量,精密稱定,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得。采用高效液相色譜(HPLC)法分析黃連、虎杖提取物中指標成分鹽酸小檗堿與虎杖苷的溶解情況,進而判斷黃連、虎杖提取物在不同溶劑中的溶解性能,為乳化劑與助乳化劑的篩選提供參考,結果見表1。

表1 黃連提取物及虎杖提取物在各溶劑的溶解度Tab.1 SolubilityofCoptisrootandPolygonumcuspidatumextract in different adjuvants mg·g-1

由考察結果可知,不同溶劑對黃連提取物的溶解能力為:1,2-丙二醇＞PEG400＞丙三醇＞TW80＞HS15＞RH40＞EL35＞RH60＞OP。不同輔料對虎杖提取物的溶解能力為:1,2-丙二醇＞PEG400＞丙三醇＞OP＞TW80＞EL35＞HS15＞RH40＞RH60。

2.1.2 油相和助乳化劑的初步選擇 根據茶油及復方微乳中藥物黃連提取物、虎杖提取物的有效成分特性,茶油既可作為藥物,又可作為油相,為減少輔料,直接選用茶油作為油相。

助乳化劑(cosurfactant,COS)可以輔助溶解藥物和乳化劑,進一步降低表面張力,同時可以增大乳滴界面膜的柔順性,促進曲率半徑很小膜的形成[9]。由黃連提取物及虎杖提取物在不同輔料中的溶解性能考察可知,1,2-丙二醇對鹽酸小檗堿、虎杖苷均有較大溶解度,因此選擇1,2-丙二醇作為COS。

2.1.3 乳化劑的篩選 乳化劑是形成微乳的基本物質,其主要作用是降低界面張力形成界面膜,促使微乳形成。較為常用的有聚氧乙烯型、聚山梨酯類等[9]。本實驗結合上述溶解度實驗的測定結果外,還需考察乳化劑對茶油增溶量。因此考察EL-35、RH40、RH60、HS15、TW-80、OP等6種乳化劑對茶油的增溶量,篩選最佳乳化劑。

首先配制3 g表面活性劑的水溶液(其中乳化劑的質量占20%,1,2-丙二醇的量為20%)。再將表面活性劑的水溶液置于(25.0±0.5)℃恒溫水浴鍋中,移液槍逐滴(每滴10 μL)加入油相,直至溶液渾濁[10]。茶油在6種表面活性劑中的增溶效果見表2。

表2 茶油對6種表面活性劑增溶結果Tab.2 Solubilization of tea oil on six surfactants

由考察結果可知,6種乳化劑對茶油增溶量考察結果為:EL35＞RH40＞HS15＞RH60＞TW80、OP。

2.1.3.1 偽三元相圖篩選乳化劑 由乳化劑對茶油增溶量考察結果可知,EL35、RH40、HS15 3種乳化劑對茶油增溶量較大,因此,分別以EL35、RH40、HS15為乳化劑進一步篩選最優乳化劑。

將乳化劑/COS(1∶1)組成的混合乳化劑與油相按一定比例混合,在75℃磁力攪拌下,滴加純化水,直至透明澄清的微乳形成,記錄臨界成乳比例,然后繼續滴加純化水,至外觀不再發生變化。按油、水、混合乳化劑臨界點的質量百分比,在偽三元相圖中繪制曲線,確定O/W型微乳區,并計算其面積。微乳區越大,意味著被大量稀釋后微乳的乳滴形態和微乳穩定性基本保持不變。結果見圖1。從微乳區面積可知,EL35＞HS15＞RH40,說明EL35對茶油的乳化能力最強,故選擇其為表面活性劑。

A.EL35;B.RH40;C.HS15圖1 不同乳化劑的偽三相圖(Km=1∶1,75℃)A.EL35;B.RH40;C.HS15Fig.1 Pseudoternary phase diagrams of different emulsifiers(Km=1∶1,75℃)

2.1.3.2 不同Km值對微乳形成的影響 Km為乳化劑與COS的質量比。以茶油為油相,EL-35為乳化劑,1,2-丙三醇為COS,考察在不同Km值(1∶1,1∶2,2∶1)條件下所形成的微乳區域。精密稱取混合乳化劑(S/ CoS)和油相按一定質量比混合,在75℃、1 700 r·min-1磁力攪拌條件下滴加純化水,直至透明澄清的微乳形成,記錄臨界成乳比例,繪制偽三元相圖,結果見圖2。

E.Km=1∶1;F.Km=2∶1圖2 不同Km的偽三元相圖(75℃)E.Km=1∶1;F.Km=2∶1Fig.2 Pseudoternary phase diagrams of different Km(75℃)

結果:Km值為1∶2時不成微乳;當Km值為2∶1和1∶1所成微乳區面積相差不大,由于藥物黃連提取物與虎杖提取物在助乳化劑1,2-丙二醇中有較大的溶解度,選擇Km值為1∶1載藥量更大,綜合考慮選擇Km值為1∶1。

2.2 處方粒度及穩定性考察 從茶油/EL-35/1,2-丙二醇/水體系的偽三相圖中選取含茶油比例較大的4個點(油∶混合乳化劑分別為1∶15,1∶14,1∶13,1∶12)確定處方,對其粒徑進行評價,結果見表3。

表3 4種處方粒度及穩定性考察結果Tab.3 Results of particle size distribution and stability in four kinds of prescription

由結果可知,油與混合乳化劑比例為1∶12時形成的微乳不穩定,比例為1∶13時,粒徑較大,為確保含藥微乳的形成及工藝的重復性,選擇油與混合乳化劑比例為1∶14。

2.3 制備工藝對微乳的影響 微乳的制備工藝與溫度,轉速,攪拌時間密切相關,因此采用單因素實驗法,考察溫度、轉速、攪拌時間對微乳制備工藝的影響。本實驗以微乳的粒徑為指標,采用單因素實驗法,考察溫度、轉速、攪拌時間對微乳制備工藝的影響。結果見表4～表6。結果:75℃條件下,1 400 r·min-1攪拌20 min,可得到較理想的微乳。

2.3.1 溫度考察 考察60,75,90℃3個溫度, 1 700 r·min-1的磁力攪拌器中攪拌30 min。見表4。

2.3.2 轉速考察 在75℃條件下,分別考察1 100, 1 400,1 700 r·min-1。見表5。

2.3.3 攪拌時間考察 在75℃、1 400 r·min-1條件下分別考察攪拌時間10,20,30 min,結果見表6。

表4 3種制備溫度考察結果Tab.4 Results of three kinds of preparation temperature

表5 3種轉速考察結果Tab.5 Results of rotation speed test

表6 3種制備時間考察結果Tab.6 Results of three kinds of preparation time

2.4 微乳的制備 取黃連提取物、虎杖提取物,分別加至1,2-丙二醇中,充分溶解后,微孔濾膜濾過,按比例混合,調節pH,即得含藥丙二醇,按處方比例加入茶油、EL35、含藥丙二醇、水,75℃條件下,1 400 r·min-1攪拌20 min,即得微乳(黃連提取物∶虎杖提取物∶茶油∶EL35∶1,2-丙二醇∶水的質量比為1∶1.4∶1∶7∶7∶21)。

2.5 微乳的理化性質評價 采用激光粒度儀測定連杖微乳粒徑及其分布。結果微乳的平均粒徑為30.9 nm,粒徑分布均勻。采用離心法,將連杖微乳放入高速離心機中,轉速12 000 r·min-1離心30 min,微乳澄清透明,未出現相分離、沉淀和渾濁等現象。連杖微乳于冰箱4℃、室溫放置3個月,外觀保持澄清透明,未見分層、絮凝和破乳。

2.6 微乳的含量測定

2.6.1 鹽酸小檗堿的含量測定

2.6.1.1 色譜條件和系統適應性 色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加入十二烷基硫酸鈉0.4 g,再以磷酸調節pH為4.0);檢測波長為345 nm;柱溫為30℃;流速為0.6 mL·min-1。理論板數按小檗堿峰計應不低于5 000。在此色譜條件下,微乳中輔料對鹽酸小檗堿的測定無干擾。色譜圖見圖3。

A.供試品;B.鹽酸小檗堿對照品;C.陰性對照溶液;1.鹽酸小檗堿圖3 鹽酸小檗堿含測專屬性圖譜A.sample;B.berberine hydrochloride reference;C.negative control solution;1.berberine hydrochlorideFig.3 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride

2.6.1.2 供試品溶液的制備 精密量取連杖微乳5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。陰性微乳溶液同法制備。

2.6.1.3 標準曲線的繪制 取鹽酸小檗堿對照品5.0 mg,精密稱定,置10 mL量瓶,加甲醇溶解,微孔濾膜濾過,即得。精密吸取對照品溶液2,4,8,12,16,20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜峰面積,按“2.6.1.1”項操作方法進樣分析,以色譜峰面積(Y)對鹽酸小檗堿質量(X,μg)進行線性回歸,得回歸方程為Y=5 584 062. 215 6X+809 040.779 9,r=0.999 3;表明鹽酸小檗堿在0.925～9.253 μg范圍內均呈良好線性關系。

2.6.1.4 精密度考察 吸取鹽酸小檗堿對照品溶液適量,微孔濾膜濾過,取續濾液,按“2.6.1.1”項方法連續測定6次,記錄色譜峰面積,計算精密度,結果平均峰面積為23 875 933,RSD為0.67%(n=6),說明儀器精密度良好。

2.6.1.5 穩定性考察 按照“2.6.1.1”項色譜條件,精密量取連杖微乳5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜濾過,于0,2,4,8,12,24 h分別測定,記錄峰面積,鹽酸小檗堿含量測定結果RSD為0.44%,表明連杖微乳供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.6.1.6 重復性實驗 分別精密量取連杖微乳5 mL6份,分別置10 mL量瓶,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜濾過,按照“2.6.1.1”項色譜條件測定。由實驗結果可知,鹽酸小檗堿含量RSD為1.99%,結果表明重復性良好。

2.6.1.7 加樣回收率實驗 取己知含量的連杖微乳6份各2.5 mL,置10 mL量瓶,分別加入鹽酸小檗堿對照品溶液(2.25 mg·mL-1)2 mL,加甲醇稀釋至刻度,按照“2.6.1.1”項色譜條件測定。結果鹽酸小檗堿平均回收率為99.16%,RSD為2.47%。表明本方法回收率良好。

2.6.1.8 鹽酸小檗堿含量測定 取3批同一處方的連杖微乳,按照“2.6.1.2”項供試品制備方法制備供試品溶液,按照“2.6.1.1”項色譜條件進行測定,結果連杖微乳中鹽酸小檗堿含量分別為1.76,1.83, 1.81 mg·mL-1,平均1.80 mg·mL-1。

2.6.2 虎杖苷的含量測定

2.6.2.1 色譜條件和系統適應性 色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-水(23∶77);檢測波長為306 nm;柱溫為30℃;流速為1.0 mL·min-1。理論板數按虎杖苷峰計應不低于3 000。在此色譜條件下,微乳中輔料對虎杖苷的測定無干擾。色譜圖見圖4。

A.供試品;B.虎杖苷對照品;C.陰性對照溶液;1.虎杖苷圖4 虎杖苷含測專屬性圖譜A.sample;B.polydatin reference;C.negative control solution; 1.polydatinFig.4 HPLC chromatograms of Polydatin

2.6.2.2 供試品溶液的制備 精密量取連杖微乳1 mL,置10 mL量瓶,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。同法制備陰性微乳溶液。

2.6.2.3 標準曲線的繪制 取經五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品適量,精密稱定,加稀乙醇稀釋成濃度為30.32 μg·mL-1。精密吸取混合對照品溶液2,4,8,12,16,20,30 μL注入液相色譜儀,記錄色譜峰面積。以色譜峰面積(Y)對鹽酸小檗堿的質量(X,μg)進行線性回歸,得回歸方程為Y= 3 541 308.276 5X+6 336.880 2,r=0.999 9。表明虎杖苷在0.060 64～0.909 60 μg范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.6.2.4 精密度考察 按照“2.6.2.1”項色譜條件,吸取虎杖苷對照品溶液適量,微孔濾膜濾過,取續濾液,連續測定6次,記錄色譜峰面積,計算精密度,結果平均峰面積為1 079 758,RSD為0.28%(n=6),說明儀器精密度良好。

2.6.2.5 穩定性考察 按照“2.6.2.1”項色譜條件,精密量取連杖微乳1 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜濾過,于0,2,4,8,12,24 h分別測定,記錄峰面積,虎杖苷24 h內含量測定結果RSD為0.80%,表明連杖微乳供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.6.2.6 重復性考察 分別精密量取6份連杖微乳1 mL,置10 mL量瓶,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜濾過,按照“2.6.2.1”項色譜條件測定。由實驗結果可知,虎杖苷含量RSD為1.28%,表明重復性良好。

2.6.2.7 加樣回收率考察 取己知含量的連杖微乳6份各0.5 mL,置10 mL量瓶,分別加入虎杖苷對照品溶液(0.45 mg·mL-1)2 mL,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,按照“2.6.2.1”項色譜條件測定。結果表明,虎杖苷平均回收率為98.27%,RSD為1.02%,結果表明本方法回收率良好。

2.6.2.8 虎杖苷含量測定 取同一處方的3批連杖微乳,按照“2.6.2.2”項供試品溶液制備方法制備供試品溶液,按照“2.6.2.1”項色譜條件進行測定,結果連杖微乳中虎杖苷含量分別為0.34,0.33,0.33 mg·mL-1,平均0.33 mg·mL-1。

3 討論

在處方研究中,由于處方中已經含有茶油,為減少處方組分及乳化劑用量,單獨以茶油作為微乳油相。

乳化劑與COS比例Km值篩選過程中,Km值為2∶1時的微乳區稍微比Km值為1∶1時的要大,但是考慮黃連、虎杖提取物主要溶解于COS1,2-丙二醇中,為提高微乳中藥物有效成分的含量,選擇乳化劑與COS比例為1∶1。

本制劑同時含有難溶性的黃連生物堿、虎杖蒽醌及二苯乙烯類和低極性茶油等有利于燒燙傷康復的成分,后續測定表明表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿等含量顯著高于常用油劑。

由于植物油微乳化較難,本制劑植物油比例較低。國外對植物油微乳適用乳化劑開展較多研究,開發了乳化增溶效果更佳的乳化劑,如文獻[11-12]制備了含乳化劑用量為3%～4%的大豆油、瓜子油、橄欖油等植物油微乳,為該類制劑的研究提供了參考。

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.024

Preparation of Lianzhang Microemulsion

LIN Li1,YIN Shan-shan1,LIU Pan1,ZHU Li2,CHEN Wei3,LIN Ji1,ZHANG Jun1
(1.NewDrug Research and Development Center,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China;2.Guangdong College of Pharmacy,Guangzhou 510006,China;3.Guangzhou Pharmaceutical Research Institute Co.Ltd., Guangzhou 510240,China)

ObjectiveTo preparelianzhangmicroemulsion and investigate its physicochemical properties.MethodsThe formulation was optimized with the pseudo-ternary phase diagrams drawn in a titration method.The process parameters were screened by a single factor test,and the physical and chemical properties of the microemulsion were preliminarily studied.ResultsThe formulation oflianzhangmicroemulsion was as follows:copts root extracts:polygonumcuspidatumextracts∶tea oil∶EL35∶propylene glycol∶water as 1∶1.4∶1∶7∶7∶21.The microemulsion was obtained with mean diameter of 30.9 nmby stirring the solution for 20 min at 1 400 r·min-1and 75℃.The particles were uniformly distributed,and the microemulsion was clear and transparent without turbidity,phase separation and precipitation after the temperature test and acceleration test.ConclusionThe preparation technology oflianzhangmicroemulsion is simple and stable.

Lianzhangmicroemulsion;Preparation technology;Quality evaluation

R286;TQ460.1

A

1004-0781(2014)07-0926-06

2013-10-07

2013-11-12

林麗(1988-),女,廣東高州人,在讀碩士,主要從事中藥新藥藥學研究。E-mail:linli1220@yeah.net。

張軍(1971-),男,研究員,碩士生導師,主要從事中藥新藥藥學研究。E-mail:zhjxsh@aliyun.com。