一測多評法測定鎖陽中3種有效成分

2014-05-13 10:06:12楊瀚春王榮何家田夏鵬霄謝華

醫藥導報 2014年7期

楊瀚春,王榮,何家田,夏鵬霄,謝華

(1.解放軍第513醫院藥劑科,甘肅東風 732750;2.蘭州軍區蘭州總醫院全軍臨床藥理基地,蘭州 730050;3.蘭州大學藥學院,蘭州 730000;4.蘭州軍區藥品儀器檢驗所,蘭州 730050)

一測多評法測定鎖陽中3種有效成分

楊瀚春1,王榮2,3,何家田4,夏鵬霄1,謝華2

目的建立同時測定鎖陽中兒茶素(CA)、沒食子酸(GA)、原兒茶酸(PR)的高效液相色譜一測多評法。方法以鎖陽中CA、GA、PR為考察指標,建立CA、GA、PR間的相對校正因子,并用校正因子計算CA、GA、PR的含量,將一測多評法的計算值與外標法實測值進行比較。結果建立了鎖陽中3種成分的一測多評法;一測多評法的計算值與外標法實測值之間差異無統計學意義。結論同時測定鎖陽中CA、GA、PR等3種成分的一測多評法方法可靠,結果準確,可用于控制鎖陽藥材及飲片的質量。

鎖陽;兒茶素;沒食子酸;原兒茶酸;一測多評法

鎖陽亦稱不老藥,又名銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉,為鎖陽科植物鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉質莖[1]。鎖陽中含有的兒茶素(catechin,CA)具有提高免疫功能、抗氧化等活性,沒食子酸(gallic acid,GA)具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用;原兒茶酸(protocatechic acid,PR)具有增加冠狀動脈血流量、降低心肌耗氧量的作用,在體外具有明顯抑制血小板聚集的活性和抗菌活性[2-3]。本實驗采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定CA、GA、PR的含量,并利用以上3種成分內在的函數和比例關系,采用一測多評的方法[4-5],計算CA、GA、PR相互之間的相對校正因子(f)和3種成分的含量,為客觀評價鎖陽及其中成藥的質量提供了新的分析模式。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀,Waters 996二極管矩陣檢測器,Millennium32色譜工作站(美國Waters);十萬分之一電子天平(Metter AE240型);超聲波提取器(SK5200H,上海科導超聲儀器有限公司);離心機(Anke TGL-16B,上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥 CA對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110877-200001)、GA對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110831-200302)、PR對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110809-200503),均供含量測定用,純度均≥98%;乙腈為色譜純(天津四友);水為滅菌注射用水;其余試劑均為分析純。鎖陽藥材及飲片來源:東風場區(飲片)由楊瀚春采挖并切制,東風場區藥材由夏鵬霄采挖,甘肅金塔藥材由當采挖,內蒙古古日乃和內蒙古額濟納旗藥材由當地采挖,烏魯木齊(飲片)購自當地藥店,蘭州(飲片)取自蘭州軍區決醫院藥房。均由蘭州大學藥學院馬志鋼教授鑒定為Cynomorium songaricum Rupr.。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18柱(4.6 mm× 250 mm,2.5 μm);流動相:乙腈∶水∶36%乙酸(8∶92∶0.1);流速:1.0 mL·min-1;檢測波長為258.7 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μL。理論板數按CA峰計算應不低于2 000。

2.2 對照品溶液的制備取CA、GA、PR對照品適量精密稱定,置于同一個10 mL量瓶中,加滅菌注射用水適量,超聲10 min,加水至刻度,配制成含CA 0.118 mg·mL-1、GA0.126mg·mL-1、PR 0.147 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取鎖陽粉末[過篩孔內徑0.425 mm(40目)篩)]約1.0 g,精密稱定,置50 mL量瓶,精密加入滅菌注射用水20 mL,稱定質量,超聲處理30 min,放冷,再稱定質量,離心,上清液用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過,置棕色瓶中,即得。取對照品溶液與供試品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,測定。結果見圖1。

2.4 線性關系考察精密吸取上述混合對照品溶液0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 mL,分別置5 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,依次取稀釋后的混合對照品溶液及未稀釋的混合對照品溶液各20 μL進樣,按上述色譜條件測定,以對照品進樣量(μg)為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線并回歸處理。結果表明, CA在0.047 2～1.510 0 μg范圍內、GA在0.050 4～1.610 0 μg范圍內、PR在0.058 8～1.880 0 μg范圍內線性關系良好。回歸方程:兒茶素Y=82 466.81X+ 281.83,r=0.999 9、沒食子酸Y=886 294.46X+ 1 485.33,r=0.999 6,原兒茶酸Y=2 136 116.67X+ 5 884.29,r=0.999 8。

圖1 對照品(A)與樣品(B)HPLC色譜圖

2.5 精密度實驗取同一混合對照品溶液重復進樣6次(每次20 μL),樣品峰面積積分值的日內RSD分別CA 3.67%、GA 3.47%、PR 2.19%;日間RSD分別為CA 4.24%、GA 3.89%、PR 3.08%。

2.6 穩定性實驗精密吸取同一樣品溶液,在24 h內按擬定的時間間隔重復進樣8次,每次進樣20 μL,樣品中3種成分的平均含量分別為CA 4.176 8 mg·g-1, RSD為4.84%;GA 0.672 1 mg·g-1,RSD為4.10%;PR 0.131 5 mg·g-1,RSD為4.32%。

2.7 重復性實驗取同一批樣品(甘肅金塔)6份,精密稱定,分別按“2.3”項供試品溶液制備方法制備成6份樣品液,進樣,分析,結果平均含量CA為4.174 0 mg·g-1, RSD為4.18%;GA為0.672 1 mg·g-1,RSD為3.99%;PR為0.131 2 mg·g-1,RSD為4.14%。說明本法的重復性較好。

2.8 加樣回收率實驗取已測定含量的鎖陽樣品(甘肅金塔)6份精密稱定,分別加入相應量的對照品,按“2.3”項供試品溶液制備方法操作,進樣20 μL,測得CA的平均回收率為100.6%,RSD為3.35%;GA的平均回收率為101.2%,RSD為2.36%;PR的平均回收率為97.90%,RSD為3.14%。

2.9 相對校正因子的計算分別以CA、GA、PR為內參物,根據相對校正因子計算公式[4],分別計算各待評價成分與內參物的相對校正因子,見表1～3。

2.10 色譜峰定位 “一測多評”法色譜峰的準確定位一般可以采用保留時間差或相對保留值等參數結合色譜圖整體特征,以及每個峰的紫外吸收特征來定位其余待測成分(a,b,…,i,…)色譜峰[6]。相對保留值指各待測成分與內參物s間保留時間的比值,計算公式:ras=tRa/tRs;保留時間差指各待測成分與內參物S間保留時間的差值,計算公式:ΔtRas=tRa-tRs。

表1 以CA為內參物的相對校正因子計算結果(n=2)

表2 以GA為內參物的相對校正因子計算結果(n=2)

表3 以PR為內參物的相對校正因子計算結果(n=2)

本研究分別考察相對保留值和保留時間差的重復性。結果表明保留時間差有一定的波動,RSD介于3%～4%;相對保留值的波動相對較小,RSD＜1%,因此采用相對保留值進行鎖陽中CA、GA、PR等成分色譜峰的定位較為可行。見表4～6。

表4 以CA為內參物的相對保留值(n=2)

表5 以GA為內參物的相對保留值(n=2)

2.11 樣品測定分別取各批藥材制備供試品溶液。分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各20 μL,高效液相色譜儀進樣測定。分別采用外標法和“一測多評”法計算鎖陽中CA、GA、PR的含量,結果見表7～9。采用“一測多評”法及外標法所測得的鎖陽中CA、GA、PR的含量基本一致,表明“一測多評”法可用于鎖陽藥材中CA、GA、PR的含量測定。

表6 以PR為內參物的相對保留值(n=2)

3 討論

由表1～6可見,以不同的進樣量測得的3種成分間的相對校正因子和相對保留值變異不大;由表7～9可見,“一測多評”法與外標法測得的結果非常接近,表明“一測多評”法可以用于中藥多種成分的質量控制。由表9可以看出,由于藥材中PR和CA的含量相差較大,并且PR和CA回歸方程的截距相差較大,致使以PR為內參物計算樣品含量時,藥材中以外標法和QAMS法測定的CA含量的相對偏差偏大。因此,在實驗中應進一步提高實驗精度,使多個回歸方程的截距相近。