鱉甲煎丸對大鼠長期毒性的實驗研究

熊婧，李霞，曾凡波，陳鵬，翟莉

(1.武漢健民藥業集團股份有限公司，武漢 430052；2.華中科技大學同濟醫學院藥學院，武漢 430030)

鱉甲煎丸對大鼠長期毒性的實驗研究

熊婧1，李霞1，曾凡波2，陳鵬1，翟莉1

(1.武漢健民藥業集團股份有限公司，武漢 430052；2.華中科技大學同濟醫學院藥學院，武漢 430030)

目的 觀察鱉甲煎丸對大鼠的毒性反應,確定其安全劑量,為擬定人用劑量提供參考。方法SD大鼠60只,隨機分為鱉甲煎丸低、高劑量組和對照組,每組20只,分別灌胃給予低、高劑量鱉甲煎丸藥液(相當于生藥5, 10 g·kg-1)和純化水2mL,連續給予6個月。觀察大鼠一般狀況、體質量及進食量,給藥結束及停藥4周后檢查血常規、血液生化學指標及臟器系數、組織病理學變化。結果鱉甲煎丸低、高劑量組大鼠一般狀況、體質量、進食量、血常規、血液生化學指標及臟器系數與對照組比較均差異無統計學意義,亦未見異常組織病理學變化。結論鱉甲煎丸對大鼠血常規、血液生化學指標無明顯影響,對臟器的長期毒性低,未發現毒性靶器官,長期服用安全。

鱉甲煎丸；毒性,長期；大鼠

鱉甲煎丸源于張仲景《金匱要略·瘧癥》篇,具活血化瘀、軟堅散結之功效,用于脅下癥塊［1-3］。臨床上除用于治療因瘧疾等各種原因引起的肝脾大、肝硬化等癥外,也用于惡性腫瘤的治療,且在治療子宮肌瘤、黃褐斑、心絞痛及高脂血癥等方面亦取得較好療效［3］,但對鱉甲煎丸的長期毒性研究筆者鮮見報道。為探討鱉甲煎丸長期服用安全性,觀察其毒性反應的靶器官及其損害的可逆性,筆者對其進行了長期毒性實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥物與試劑 鱉甲煎丸由武漢中聯藥業集團股份有限公司提供(批號:100160),實驗前用純化水配制成不同濃度的藥液,備用。總蛋白(total protein,TP)檢測試劑盒(批號:101014)、清蛋白(albumin,ALB)檢測試劑盒(批號:101003)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測試劑盒(批號:101101)、血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)檢測試劑盒(批號:101005)、肌酐(creatinine, Crea)檢測試劑盒(批號:101008),均由北京化工廠生產；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)檢測試劑盒(批號:100916),血糖(blood glucose,GlU)檢測試劑盒(批號:100925),總膽固醇(total cholesterol,TC)檢測試劑盒(批號:101102),均由上海榮盛生物技術有限公司生產。

1.1.2 儀器 Hematology Analyzer-Mek-5108kg型自動檢測儀。

1.1.3 實驗動物 純種SD大鼠,5～6周齡,體質量(80±10)g,雌雄各半,購于湖北省實驗動物研究中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(鄂)2008-0005,實驗動物合格證號:湖北省醫學實驗動物字第19-053號,清潔(Ⅱ)級。實驗前1周進入實驗室,按正常供食(普通鼠飼料)、供水飼養,室溫(25±2)℃,空氣濕度50%～65%,以適應本實驗室環境。實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2008-0009。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 取純種SD大鼠60只,隨機分為3組,每組20只,分別為對照組、鱉甲煎丸低劑量組(生藥5 g·kg-1,相當于人用量的16.5倍)、鱉甲煎丸高劑量組(生藥10 g·kg-1,相當于人用量的33.0倍)。對照組每只給予純化水2 mL灌服；鱉甲煎丸低、高劑量組分別灌服相應劑量濃度的藥液,每只灌服體積為2 m L,并每周稱大鼠體質量,按大鼠體質量變化調整給藥量,以保證低、高劑量組的給藥劑量。各組每日以等體積給藥1次,連續給藥6個月。按觀察指標中的要求檢測各項指標［4］。

1.2.2 大鼠一般狀況、體質量及進食量觀察 在用藥期間逐日觀察大鼠進食量,外觀體征和行為活動,糞便性狀,每周稱體質量一次并觀察動物皮毛。發現中毒反應的動物取出單籠飼養,發現死亡或瀕臨死亡動物,及時尸檢。

1.2.3 血常規檢查 在實驗中期(90 d)、實驗結束(180 d)和停藥14 d后,檢查血常規,即外周血中的紅細胞計數、血紅蛋白(hemoglobin,HB)含量測定、白細胞計數及分類。

1.2.4 血液生化學檢查 在實驗中期與結束和停藥14 d后,分別取大鼠血樣測定TP、ALB、GLU、ALP、ALT、Crea、TC、BUN。

1.2.5 系統尸檢、臟器系數及組織病理學檢查 在實驗結束時,各組通過斷頸處死(尸檢前稱體質量)1/2的動物,全面細致觀察動物的腦、心、肝、肺、脾、腎、胃、腸、甲狀腺、腎上腺、睪丸、子宮、卵巢等主要臟器,并稱各臟器質量,計算動物各臟器質量與體質量之比(臟器系數)。另在各組動物已處死作尸檢的基礎上,每組各取5只動物的心、肝、腎、脾、肺、胃以10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(hematoxylineosinstaining,HE)染色,光鏡觀察組織學變化,并對各組的組織學變化進行統計分析處理,判斷組間差異。

1.2.6 恢復性觀察 各組在停藥28 d后,對余下動物作上述各項指標檢查,對各主要臟器進行尸檢與臟器系數測定,以觀察毒性反應的可逆程度和可能出現的延遲毒性。

2 結果

2.1 對大鼠一般狀況、體質量及進食量的影響 實驗期間各組動物毛色光滑、活動自如、攝食、飲水、糞便均正常,生長發育良好,未發現中毒現象。給藥前各組動物體質量差異無統計學意義(P>0.05)；給藥期間各組動物體質量逐周增加,實驗結束后各組之間的體質量變化差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1,2。

2.2 對大鼠血常規及血液生化學指標的影響 在不同時期檢查血常規,各組之間的血常規、血液生化學指標均差異無統計學意義(P>0.05),并均在正常值范圍內。結果見表3,4。

2.3 對大鼠臟器系數及組織病理學的影響 實驗結束及停藥4周后各組動物處死解剖,腦、心、肝、脾、肺、胃、腸、腎、腎上腺、甲狀腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮等主要臟器的大小、形狀、顏色、質地均正常,肉眼未發現可見病變,各組臟器系數［g·(100 g)-1］均差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表5。組織病理學觀察顯示,鱉甲煎丸低、高劑量組與對照組比較,給藥期被檢臟器組織結構、細胞形態均未發現明顯由藥物引起的病理改變,恢復期后亦未發現明顯延遲毒性反應,提示鱉甲煎丸對大鼠主要臟器無明顯損害和毒性反應。

表1 3組大鼠(雄性)實驗期間的體質量比較Tab.1 Comparison of body weight am ong three groups of rats(male)during the experim ent g,±s

表1 3組大鼠(雄性)實驗期間的體質量比較Tab.1 Comparison of body weight am ong three groups of rats(male)during the experim ent g,±s

組別大鼠/只實驗前第2周第4周第6周第8周第10周第12周鱉甲煎丸低劑量組20 84.5±3.9 106.4±7.4 119.7±7.6 136.8±7.9 157.4±9.5 186.5±19.8 221.6±23.4高劑量組20 86.3±4.6 104.5±5.7 120.5±8.5 137.7±7.9 158.4±11.7 181.2±21.5 220.4±22.5對照組20 85.4±3.8 102.5±6.3 118.5±7.5 138.6±8.9 158.6±10.5 185.5±22.1 224.3±25.1組別第14周第16周第18周第20周第22周第24周第28周鱉甲煎丸低劑量組249.7±23.5 263.5±23.9 276.4±33.3 286.5±37.6 296.7±37.9 320.1±35.5 359.4±43.4高劑量組249.1±21.3 259.3±24.1 274.3±35.7 280.5±29.5 301.1±36.9 318.3±31.7 351.5±51.4對照組253.6±24.7 267.6±26.3 271.5±31.5 280.4±32.9 308.4±35.6 325.4±31.4 354.7±54.6

表2 3組大鼠(雌性)實驗期間的體質量比較Tab.2 Comparison of body weight among th ree groups of rats(female)during the experim ent g,±s

表2 3組大鼠(雌性)實驗期間的體質量比較Tab.2 Comparison of body weight among th ree groups of rats(female)during the experim ent g,±s

組別大鼠/只實驗前第2周第4周第6周第8周第10周第12周鱉甲煎丸低劑量組20 76.4±5.1 86.7±6.3 102.5±7.7 120.6±9.1 129.6±10.5 136.8±11.5 155.8±19.5高劑量組20 76.4±4.7 84.6±6.6 101.3±7.4 120.1±7.7 129.5±10.1 139.6±18.6 159.3±21.1對照組20 75.5±4.7 82.3±4.6 98.6±6.6 118.8±8.7 127.3±11.4 135.7±12.4 154.6±18.6組別第14周第16周第18周第20周第22周第24周第28周鱉甲煎丸低劑量組185.6±20.1 210.6±20.1 223.1±21.4 239.4±22.8 256.3±30.1 268.5±30.4 289.8±37.1高劑量組189.2±22.1 209.6±22.1 220.1±21.1 238.9±19.6 258.2±31.7 271.5±30.6 295.6±39.7對照組183.5±21.3 206.4±21.8 219.6±26.3 235.3±28.7 252.6±31.7 269.1±33.7 287.6±41.3

表3 3組大鼠實驗期間紅細胞、白細胞、HB、多核細胞和淋巴細胞的變化Tab.3 Changes of red blood cells,white blood cells,HB,multinucleated cells and lym phocytes in three groups rats during the experiment ±s

表3 3組大鼠實驗期間紅細胞、白細胞、HB、多核細胞和淋巴細胞的變化Tab.3 Changes of red blood cells,white blood cells,HB,multinucleated cells and lym phocytes in three groups rats during the experiment ±s

組別與時間大鼠/只紅細胞/ (×1012·L-1)白細胞/ (×109·L-1) HB/ (g·L-1)多核細胞/ %淋巴細胞/ %鱉甲煎丸低劑量組20給藥90 d 7.63±0.63 12.05±3.46 11.94±1.42 19.63±4.86 80.37±7.85給藥180 d 8.53±0.75 11.94±2.56 11.73±1.41 18.94±5.77 81.06±7.75停藥14 d 8.94±0.64 11.83±3.51 11.96±1.49 19.74±3.84 80.26±8.37鱉甲煎丸高劑量組20給藥90 d 7.51±0.55 12.06±2.42 12.64±1.95 20.76±4.98 79.24±8.73給藥180 d 8.28±0.36 11.41±3.75 11.65±1.72 19.52±5.32 80.48±9.32停藥14 d 8.51±0.55 12.69±4.02 12.28±1.21 19.56±3.85 80.44±8.33對照組20給藥90 d 7.84±0.54 11.64±2.45 12.47±1.25 20.68±5.64 79.32±8.35給藥180 d 8.45±0.68 12.83±3.45 11.65±1.31 19.79±4.86 80.21±8.63停藥14 d 8.46±0.74 12.54±4.15 12.06±1.63 19.12±4.24 80.88±9.37

表4 3組大鼠實驗期間血液生化學指標的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats during the experiment ±s

表4 3組大鼠實驗期間血液生化學指標的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats during the experiment ±s

組別與時間大鼠/只AST ALP (U·L-1) TP ALB (g·L-1)鱉甲煎丸低劑量組20給藥90 d 39.5±9.7 108.3±16.4 62.6±3.2 47.7±4.6給藥180 d 41.8±11.2 101.5±12.4 67.4±4.2 49.2±5.1停藥14 d 40.9±10.6 103.5±13.7 68.3±5.2 51.9±4.9鱉甲煎丸高劑量組20給藥90 d 40.8±12.7 113.7±17.3 68.5±4.7 44.7±5.3給藥180 d 41.7±11.3 107.3±12.4 66.9±4.7 47.3±4.2停藥14 d 40.1±10.3 102.4±10.4 66.2±4.9 52.1±4.7對照組20給藥90 d 41.3±12.5 110.6±18.5 66.4±4.1 46.3±3.6給藥180 d 40.6±11.4 103.4±11.4 65.7±3.9 48.2±4.1停藥14 d 41.5±10.4 100.8±14.5 66.3±4.4 51.1±5.6

續表4 3組大鼠實驗期間血液生化學指標的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats du ring the experiment ±s

續表4 3組大鼠實驗期間血液生化學指標的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats du ring the experiment ±s

組別與時間GLU BUN TC (mmol·L-1) Crea/ (μmol·L-1)鱉甲煎丸低劑量組給藥90 d 5.3±0.6 8.3±0.6 2.4±0.6 56.2±7.3給藥180 d 5.3±0.5 8.0±0.6 2.2±0.4 54.6±6.8停藥14 d 5.2±0.5 8.7±0.6 2.3±0.4 55.6±6.6鱉甲煎丸高劑量組給藥90 d 5.1±0.5 8.3±0.6 2.4±0.6 53.5±5.7給藥180 d 5.2±0.5 8.3±0.6 2.3±0.3 56.7±6.1停藥14 d 5.2±0.5 8.2±0.6 2.2±0.4 58.4±7.3對照組給藥90 d 5.4±0.6 8.3±0.7 2.6±0.6 59.4±8.3給藥180 d 5.2±0.5 7.9±0.5 2.5±0.5 58.3±7.4停藥14 d 5.1±0.6 8.4±0.6 2.4±0.5 57.5±7.7

表5 3組大鼠主要臟器系數比較Tab.5 Comparison ofmain organ coefficient among three groups of rats ±s

表5 3組大鼠主要臟器系數比較Tab.5 Comparison ofmain organ coefficient among three groups of rats ±s

組別大鼠/只腦心肝脾肺腎睪丸(雄性)鱉甲煎丸低劑量組10 0.52±0.05 0.36±0.05 3.39±0.73 0.33±0.04 0.77±0.09 0.83±0.12 0.67±0.16高劑量組10 0.53±0.05 0.35±0.06 3.41±0.69 0.33±0.05 0.78±0.12 0.83±0.11 0.68±0.15對照組10 0.53±0.04 0.35±0.06 3.41±0.77 0.34±0.05 0.78±0.11 0.82±0.13 0.68±0.18組別附睪(雄性)卵巢(雌性)子宮(雌性)前列腺(雄性)腎上腺甲狀腺胸腺鱉甲煎丸低劑量組0.16±0.02 0.08±0.01 0.23±0.06 0.16±0.03 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00高劑量組0.15±0.02 0.08±0.01 0.24±0.05 0.16±0.03 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00對照組0.15±0.02 0.08±0.01 0.24±0.05 0.16±0.02 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00

3 討論

鱉甲煎丸低、高劑量組(生藥5,10 g·kg-1,分別相當于人用量的16.5倍和33.0倍)連續灌胃給藥180 d及停藥28 d,各劑量組雌、雄大鼠體質量增長正常,飲水、進食量及一般狀況與對照組比較均差異無統計學意義(P>0.05),提示鱉甲煎丸不影響大鼠生長發育；鱉甲煎丸低、高劑量組的血常規及血液生化學指標與對照組比較均差異無統計學意義(P>0.05),提示鱉甲煎丸不影響大鼠骨髓造血功能,對肝腎功能亦無損害,不影響肝對蛋白質、糖的代謝和腎的排泄功能；主要臟器系數及組織病理學檢查均無明顯差異和異常變化,提示鱉甲煎丸對大鼠主要臟器質量和臟器系數無明顯影響。

綜上所述,在本實驗條件下對大鼠連續灌胃給藥180 d及停藥28 d后,大鼠的一般狀況、體質量變化、血常規、血液生化學、臟器系數、組織病理學檢查均未見藥物引起的毒性反應和延遲毒性反應,表明鱉甲煎丸對實驗大鼠無明顯長期毒性作用。提示大鼠連續灌胃鱉甲煎丸180 d的安全劑量為生藥10 g·kg-1(相當于人用量的33.0倍)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:人民衛生出版社,1985:477.

［2］董超,司秋菊,王貴娟.鱉甲煎丸的臨床應用與實驗研究進展[J].時珍國醫國藥,2009,20(10):2551.

［3］王貴娟,司秋菊,王興華.鱉甲煎丸現代藥理研究進展[J].中成藥,2009,31(9):1422.

［4］中華人民共和國衛生部藥政管理局.中藥新藥研究指南[M].北京:人民衛生出版社,1994:205-207.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.006

Long-term Toxicity Tests of Biejiajian Pills in Rats

XIONG Jing1,LIXia1,ZENG Fan-bo2,CHEN Peng1,ZHAILi1
(1.Wuhan Jianmin Pharmaceutical Groups Co.,Ltd.,Wuhan 430052,China;2.School of Pharmacy,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030 China)

Objective To study the long-term toxicity ofbiejiajianpills in rats,determine the safe dose,and provide reference for human use.MethodsSixty SD rats were divided into low,high dose groups,and control group,respectively (n=20 in each group),biejiajianpillswere orally administered to rats at the doses of5 and 10 g·kg-1daily for 6 months,while the control group was given with 2mLofdistilled water only.The general state,bodymass and food intakeweremeasured.By the end of the testand 4 weeks after drugwithdrawal,blood routine,hematologic and biochemical examination,organ coefficient,and histopathology were tested.ResultsCompared with the control group,no significant differences in all checked items were found in the treatment groups.ConclusionBiejiajianpills have a low long-term toxicity on the organs,blood routine, hematologic and biochemical indicators.The organ specific toxicity ofbiejiajianpills is not found.Biejiajianpill at tested doses is safe for oral use in rats.

Biejiajianpill;Toxicity,Long-term;Rats

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)01-0020-04

2012-08-01

2013-06-27

熊婧(1985-),女,湖北武漢人,助理工程師,主要從事中藥技術開發工作。電話：027-84523351,E-mail：305836524@qq.com。

陳鵬(1978-),女,湖北武漢人,工程師,主要從事中藥新藥研發工作。電話：027-84514002,E-mail：610664040@qq.com。