羅格列酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗及ROS/IKK的影響*

陳芳輝,楊人澤,羅新輝,鐘聲,李澤玲,曾韜慧,魏桂林

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科,贛州 341000)

羅格列酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗及ROS/IKK的影響*

陳芳輝,楊人澤,羅新輝,鐘聲,李澤玲,曾韜慧,魏桂林

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科,贛州 341000)

目的 探討羅格列酮對(duì)高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗(IR)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分為3組:正常對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)液,葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1);高糖組(建立高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR模型后,葡萄糖濃度為33 mmol·L-1的DMEM中培養(yǎng)24 h);羅格列酮組(建立高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR模型后,葡萄糖濃度為33 mmol·L-1的DMEM中加入10 μmol·L-1羅格列酮干預(yù)24 h)。檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞上清液一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素(ET-1)水平、線粒體膜電位和活性氧(ROS)變化,以及磷酸化I-κB激酶(p-IKK)和NF-κB抑制蛋白(IKBA)表達(dá)水平。結(jié)果與正常對(duì)照組比較,高糖組細(xì)胞存活率和NO水平下降,ET-1水平上升;線粒體膜電位下降, ROS含量升高;IKK磷酸化水平增加,IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.01),羅格列酮可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化(P＜0.05)。結(jié)論羅格列酮可改善高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IR,其機(jī)制與抑制ROS/IKK通路有關(guān)。

羅格列酮;內(nèi)皮功能障礙;胰島素抵抗;活性氧;IκB激酶

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和血管內(nèi)皮功能受損是糖尿病及心血管疾病的共同危險(xiǎn)因素,在多種代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演極其重要的角色[1]。高糖可促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量生成,ROS活化IκB激酶(IκB kinase,IKK),介導(dǎo)炎性因子的表達(dá),參與血管內(nèi)皮IR的調(diào)節(jié)[2-3]。研究表明,在肝臟、腎臟和心肌中,羅格列酮可抑制IKK表達(dá)或磷酸化,調(diào)節(jié)核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、激活蛋白-1(activating protein-1,AP-1)活性,導(dǎo)致炎癥遞質(zhì)表達(dá)減少,從而改善IR[4-6],但其在血管內(nèi)皮IR中的作用及對(duì)ROS/IKK通路的影響尚不完全清楚。筆者在本研究中旨在觀察羅格列酮對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IR的影響,并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC19 (江西省藥理學(xué)和分子治療學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供),達(dá)爾伯克伊格爾改良培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)培養(yǎng)液(上海立菲生物技術(shù)有限公司,批號(hào):8113377),羅格列酮(東京化成工業(yè)株式會(huì)社,含量>98.0%,批號(hào):5MM4N-FQ),二甲亞砜(美國(guó)Sigma,批號(hào):302A0318),胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):20130423),四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyl-tetrazolium,MTT)試劑(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):M8180),磷酸化IκB激酶(phospho-IKKα/β,p-IKKα/β)(Ser176/180)抗體(美國(guó)CST,批號(hào):2697),NF-κB抑制蛋白(inhibitory nuclear factorkappa B,IκBα)抗體(美國(guó)CST,批號(hào):9242),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(上海拓然生物科技有限公司,批號(hào):E030120-01),一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào): 20130710),人內(nèi)皮素(endothelin-1,ET-1)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):201310),線粒體膜電位試劑盒(JC-1法,上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):201304),ROS檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技有限公司,批號(hào):KGT010-1)。

1.2 建立高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR模型 造模方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[7],常規(guī)培養(yǎng)HUVEC19,待80%融合時(shí),加入含葡萄糖(33 mmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)48 h,并用100 nmol·L-1胰島素處理30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將HUVEC19分為3組:正常對(duì)照組,DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1);高糖組(建立高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR模型后,葡萄糖濃度為33 mmol·L-1的DMEM中培養(yǎng)24 h);羅格列酮組(建立高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR模型后,葡萄糖濃度為33 mmol·L-1的DMEM中加入10 μmol·L-1羅格列酮分別干預(yù)24 h),檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞上清液一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素(ET-1)水平、線粒體膜電位和活性氧(ROS)變化,以及磷酸化I-κB激酶(p-IKK)和NF-κB抑制蛋白(IKBA)表達(dá)水平。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采取MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率;按照NO和人內(nèi)皮素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞上清液NO、ET-1水平;按照線粒體膜電位試劑盒(JC-1法)、ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書,流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量及線粒體膜電位變化;Western blot法測(cè)定p-IKK和IκBα蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IR的影響見(jiàn)表1。建立高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR模型后,與正常對(duì)照組比較,高糖組細(xì)胞存活率和NO水平下降,ET-1水平上升(P＜0.01),提示造模成功[7]。與高糖組比較,羅格列酮組細(xì)胞存活率、NO水平上升,ET-1水平下降(P＜0.05)。提示羅格列酮對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IR具有保護(hù)作用。

表1 3組HUVECs存活率、NO和ET-1檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Determination of survival rate,NO and ET-1 in three groups of HUVECs ±s

表1 3組HUVECs存活率、NO和ET-1檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Determination of survival rate,NO and ET-1 in three groups of HUVECs ±s

與正常對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與高糖組比較,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;compared with HG group,*2P＜0.05

組別細(xì)胞存活率/ % NO/ (μmol·L-1) ET-1/ (pg·mL-1)正常對(duì)照組81.31±0.0253.79±5.063.75±0.27高糖組34.11±0.02*129.56±2.51*17.09±0.31*1羅格列酮組43.11±0.02*235.66±2.58*26.18±0.22*2

2.2 羅格列酮對(duì)HUVECs線粒體膜電位變化和ROS含量的影響 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較,高糖組線粒體膜電位下降,ROS水平(熒光強(qiáng)度)升高140.6% (P＜0.01)。而經(jīng)羅格列酮干預(yù)后,線粒體膜電位上升,ROS水平下降35.8%(P＜0.05)。

表2 3組HUVECs線粒體膜電位變化和ROS含量檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Determinationofmitochondrialmembrane potential and ROS in three groups of HUVECs ±s

表2 3組HUVECs線粒體膜電位變化和ROS含量檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Determinationofmitochondrialmembrane potential and ROS in three groups of HUVECs ±s

與正常對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與高糖組比較,*2P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with HG group,*2P＜0.05

組別ROS 相對(duì)產(chǎn)生量線粒體膜電位正常對(duì)照組90.06±10.401.48±0.08高糖組216.67±24.99*10.41±0.04*1羅格列酮組139.17±16.38*21.18±0.07*2

2.3 羅格列酮對(duì)p-IKK及IκBα蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖1,2。與正常對(duì)照組比較,高糖組IKK磷酸化增加, IκBα表達(dá)下調(diào);羅格列酮干預(yù)后,IKK磷酸化減少, IκBα表達(dá)相應(yīng)上調(diào)(P＜0.01或P＜0.05)。

3 討論

羅格列酮為噻唑烷二酮類胰島素增敏藥,可通過(guò)激活靶組織中的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)來(lái)增強(qiáng)胰島素傳導(dǎo)信號(hào),提高靶組織的胰島素敏感性,改善IR,抑制血管平滑肌的增殖和遷移,改善內(nèi)皮功能等[8]。

圖1 3組p-IKK及IκBα蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of p-IKK and IκBα in three groups

與正常對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與高糖組比較,*2P＜0.05圖2 3組p-IKK、IκBα蛋白與β-actin蛋白相對(duì)比值統(tǒng)計(jì)圖Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with HG group,*2P＜0.05Fig.2 Relative ratio of the p-IKK and IκBα protein to β-actin in three groups

IR是指機(jī)體對(duì)一定劑量胰島素的生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平,血管內(nèi)皮功能障礙與內(nèi)皮源性血管舒張因子NO下降、縮血管因子ET-1升高及氧化應(yīng)激等因素有關(guān)[9]。許多研究表明,IR和血管內(nèi)皮功能受損關(guān)系緊密,在代謝性疾病和心血管疾病中起了重要作用。本實(shí)驗(yàn)中,筆者采用高糖和胰島素處理HUVECs建立血管內(nèi)皮IR模型,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率、NO水平下降, ET-1水平升高,提示造模成功。而羅格列酮干預(yù)可提高細(xì)胞存活率和NO水平,降低ET-1水平,說(shuō)明羅格列酮治療后有助于維持血管內(nèi)皮完整性,對(duì)血管內(nèi)皮IR有保護(hù)作用。

在代謝過(guò)程中,高血糖可導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,誘導(dǎo)線粒體膜去極化,產(chǎn)生大量ROS,從而發(fā)生氧化應(yīng)激[10]。氧化應(yīng)激可激活細(xì)胞內(nèi)包括NF-κB、PKC、JNK、MAPK等應(yīng)激信號(hào)通路,與血管內(nèi)皮IR的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中,高糖組較正常對(duì)照組線粒體膜電位下降,ROS含量升高,而羅格列酮可有效保護(hù)線粒體膜電位,降低ROS水平,從而減少炎性因子的產(chǎn)生,增加NO生成,改善IR以及內(nèi)皮功能受損。

NF-κB是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,其參與了炎癥、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等的調(diào)節(jié)。靜息狀態(tài)下,無(wú)活性的NF-κB以異源三聚體(P50, P65,IκBα)形式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí), IKK復(fù)合體被磷酸化,磷酸化的IKK復(fù)合體繼而磷酸化降解IκBα,使NF-κB(P50,P65)轉(zhuǎn)核活化,從而引起靶基因的表達(dá)[11-12]。通過(guò)IKK/IκBα/NF-κB信號(hào)通路,IKK介導(dǎo)了細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6等)、化學(xué)趨化因子、黏附分子和促凋亡基因等表達(dá),從而參與高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮IR的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高糖作用下,IKK磷酸化顯著增加,IκBα表達(dá)相應(yīng)下降。而用羅格列酮干預(yù)48 h后,p-IKK表達(dá)減少,IκBα表達(dá)增加,說(shuō)明羅格列酮能抑制IKK活化,發(fā)揮改善血管內(nèi)皮IR的作用。

綜上所述,羅格列酮可改善高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮IR,其機(jī)制可能與抑制ROS/IKK信號(hào)通路有關(guān)。

[1] MUNIYAPPA R,SOWERS J R.Role of insulin resistance in endothelial dysfunction[J].Rev Endocr Metab Disord, 2013,14(1):5-12.

[2] QUAGLIARO L,PICONI L,ASSALONI R,et al.Intermittent high glucose enhances ICAM-1,VCAM-1 and E-selectin expression in human umbilical vein endothelial cells in culture:the distinct role of protein kinase C and mitochondrial superoxide production[J].Atherosclerosis, 2005,183(2):259-267.

[3] QI S,XIN Y,GUO Y,et al.Ampelopsin reduces endotoxic inflammation via repressing ROS-mediated activation of PI3K/Akt/NF-κB signaling pathways[J].Int Immuno Pharmacol,2012,12(1):278-287.

[4] 趙彩彥,周俊英,劉雅靜,等.羅格列酮抑制非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織IKK-β的表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2007,27(11):1231-1235.

[5] 王曉娟,劉素筠.羅格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟中磷酸化IKK和IκBα表達(dá)及腎組織超微結(jié)構(gòu)改變的影響[J].實(shí)用糖尿病雜志,2010,7(1):26-27.

[6] 祁潔,劉素筠.羅格列酮對(duì)糖尿病大鼠心肌組織中磷酸化IKK,IκBα表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)療前沿,2008,20 (3):28-30.

[7] HUANG Q R,LI Q,CHEN Y H,et al.Involvement of anion exchanger-2 in apoptosis of endothelial cells induced by high glucose through an mPTP-ROS-Caspase-3 dependent pathway[J].Apoptosis,2010,15(6):693-704.

[8] ROBINSON E,GRIEVE D J.Significance of peroxisome proliferator-activated receptors in the cardiovascular system in health and disease[J].Pharmaco Therapy,2009,122 (3):246.

[9] 曹維,陳秋.胰島素抵抗與內(nèi)皮功能障礙[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(17):3239-3241.

[10] AHMED M,MUHAMMED S J,KESSLER B,et al.Mitoehondrial proteome analysis reveals altered expression of voltage dependent anion channels in pancreatic β-cells exposed to high glucose[J].Islets,2010,2(5):283-292.

[11] RAUERT-WUNDERLICH H,SIEGMUND D,MAIER E,et al.The IKK inhibitor Bay 11-7082 induces cell death independentfrominhibitionofactivationofNFκB transcription factors[J].PLOS One,2013,8(3):e59292.

[12] RUAN H,POWNALL H J.The adipocyte IKK/NFkappaB pathway:a therapeutic target for insulin resistance[J].Curr Opin Investig Drugs,2009,10(4):346-352.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.005

Effect of Rosiglitazone on Insulin Resistance and ROS/IKK Signaling Pathway in Vascular Endothelial Cells

CHEN Fang-hui,YANG Ren-ze,LUO Xin-hui,ZHONG Sheng,LI Ze-ling,ZENG Tao-hui,WEI Gui-lin
(Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,China)

ObjectiveTo explore the protective effect of rosiglitazone on insulin resistance(IR)induced by high glucose in vascular endothelial cells and its possible mechanism.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells(HUVECs) was divided into 3 groups:the normal control group cultivated in DEME medium with 5.5 mmol·L-1glucose;the high glucose group(HG)cultivated in DEME medium with 33 mmol·L-1glucose for 24 h after the IR model was set up;the rosiglitazone group cultivated in DEME medium with 33 mmol·L-1glucose and 10 μmol·L-1of rosiglitazone for 24 h after the IR model was set up.The cell viability,nitric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),mitochondrial membrane potential,reactive oxygen species (ROS),p-IKK and IkBa protein levels were detected.ResultsCompared with the normal control,the cell viability,the level of NO and the mitochondrial membrane potential were decreased,levels of ET-1 and ROS increased,p-IKK expression was upregulated,and IκBα expression was down-regulated in HG group(allP＜0.01).Rosiglitazone reversed these changes in a timedependent manner(P＜0.05).ConclusionRosiglitazone has the protective effect on insulin resistance induced by high glucose in vascular endothelial cells via inhibiting ROS/IKK signaling pathway.

Rosiglitazone;Endothelial dysfunction;Insulin resistance;Reative oxygen species;IrB kinase

R965;R363

A

1004-0781(2014)11-1420-04

2014-03-04

2014-04-15

*江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012ZBAB205014)

陳芳輝(1985-),男,江西遂川人,主管藥師,碩士,研究方向:藥理學(xué)。E-mail:chenfh123@163.com。

魏桂林(1968-),男,江西贛州人,主任藥師,學(xué)士,研究方向:臨床藥理。E-mail:weiguilin@sina.com。