西洛他唑自微乳化釋藥系統大鼠體內藥動學

邱妍川,林鳳云,張亞紅,馬俐麗,楊建英,朱照靜

(1.重慶醫藥高等?？茖W校,重慶 401331;2.重慶市銅梁縣巴川鎮中心衛生院,銅梁 402560)

西洛他唑自微乳化釋藥系統大鼠體內藥動學

邱妍川1,林鳳云1,張亞紅1,馬俐麗1,楊建英2,朱照靜1

(1.重慶醫藥高等?？茖W校,重慶 401331;2.重慶市銅梁縣巴川鎮中心衛生院,銅梁 402560)

目的 建立測定大鼠血漿西洛他唑濃度的方法,考察西洛他唑自微乳化釋藥系統在大鼠體內的藥動學。方法利用高效液相色譜法:色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈∶水=45∶55,檢測波長285 nm,流速1.0 mL·min-1,測定大鼠灌胃西洛他唑混懸劑與自微乳化制劑后的血藥濃度,并采用3P97藥動學軟件處理數據。結果在10～500 ng·mL-1范圍內,血漿西洛他唑濃度呈線性關系,r=0.999 6,日內、日間精密度RSD均＜6.33%;大鼠灌胃給藥后,西洛他唑自微乳化制劑Cmax為(278.53±40.48)ng·mL-1,tmax為(2.81±0.44)h, AUC(0～48)為(4 205.61±297.59)mg·mL-1·h;西洛他唑混懸劑Cmax為(181.22±12.77)ng·mL-1,tmax為(3.62± 0.51)h,AUC(0～48)為(2 173.08±242.35)mg·mL-1·h,經SPSS10.0版統計軟件分析,均差異有統計學意義(P＜0.01),自微乳化制劑相對混懸劑的生物利用度為194%。結論西洛他唑自微乳化釋藥系統可顯著提高口服生物利用度。該方法專屬性強,靈敏度高,準確性好,適合大鼠血漿中西洛他唑自微乳化制劑的藥動學研究。

西洛他唑;自微乳化釋藥系統;藥動學

目前西洛他唑(cilostazol,CLT)上市的劑型主要為片劑與膠囊劑,均為普通口服制劑[1]。自微乳化釋藥系統(self-microemulsifyingdrugdeliverysystem, SMEDDS)由油相、非離子表面活性劑和助乳化劑形成的熱力學穩定、均一澄明的液體水包油。其乳滴具有巨大的比表面積,可提高水難溶性藥物的溶出,促進藥物在胃腸道的吸收及淋巴轉運[2]。因此將CLT制成SMEDDS,即CLT-SMEDDS,有望改善其吸收現狀。筆者在本實驗中建立CLT-SMEDDS大鼠血漿中藥物濃度的測定方法,通過研究體內藥動學,探討SMEDDS提高CLT口服制劑吸收的可行性。

1 材料與方法

1.1 動物 選取健康合格斯波累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠12只,雌雄各半,體質量(250±30)g,由重慶醫科大學動物實驗中心提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(渝)2007-0001,實驗動物使用許可證號:SYXK(渝)2007-0001。

1.2 試藥及其制備 CLT工作對照品及原料(重慶康樂制藥有限公司,純度:99.5%,批號:120604),地西泮原料(西安萬昌生物科技有限公司,批號:120318,純度:99.6%),肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate, IPM,美國Fluka公司,批號:1216171,21106124),聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL,美國Fluka公司,批號: 1210306,44506130),聚乙二醇-8-甘油辛酸/癸酸酯(labrasol,法國Gattefosse公司,批號:33347)。乙腈(重慶川東化工有限公司,色譜純),甲醇(重慶川東化工有限公司,色譜純),其余試劑均為分析純,水為純化水。

自制CLT-SMEDDS:稱取油相肉豆蔻酸異丙酯2.84 g,表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油4.31 g,助乳化劑聚乙二醇-8-甘油辛酸/癸酸酯1.54 g,37℃水浴, 50 r·min-1攪拌10 min,加入CLT1.53 g,同樣條件下攪拌20 min,即得CLT-SMEDDS[3]。

自制CLT混懸液:稱取CLT1.53 g,加0.5%羧甲基纖維素鈉溶液10 mL,研磨成CLT混懸液。

1.3 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀系統:由G1315B二極管陣列檢測器,G1313A全自動進樣器, Agilent1100高效液相色譜化學工作站組成(美國Agilent公司);BOND ODS-C18固相萃取柱(200 mg, 3 mL,美國Agilent公司);QL-901旋渦混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);MF1-A10超純水器(默克密理博公司);TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠);Sartorius BS210S電子天平(德國Sartorius公司); BF2000氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)。

1.4 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈∶水=45∶55;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:285 nm;柱溫: 25℃;進樣量:20 μL。

1.5 內標溶液的配制 取地西泮適量精密稱定,置于100 mL量瓶,加甲醇溶解并定容,制成10 μg·mL-1內標儲備液。精密量取內標儲備液5.0 mL于100 mL量瓶,加流動相配成500 ng·mL-1內標溶液。

1.6 標準溶液的配制 取CLT對照品適量,精密稱定,置于量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,制成5 μg·mL-1CLT儲備液。精密量取CLT儲備液5.0 mL于50 mL量瓶中,加流動相配成500 ng·mL-1的CLT標準溶液。

1.7 血漿樣品的處理

1.7.1 固相萃取小柱的處理 甲醇和純化水各6 mL活化,再用0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液3 mL平衡。

1.7.2 血液樣品的處理 精密吸取大鼠血漿0.25 mL,內標儲備液10 μL,0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液100 μL,乙腈0.6 mL,渦旋振蕩30 s,離心10 min (15 000×g),將上清液轉入10 mL試管中,加入0.01 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液5 mL混勻,置已預活化過的固相萃取小柱,常壓下使樣品通過固相萃取小柱,再用純化水15 mL沖洗,抽干,用甲醇1 mL洗脫,收集洗脫液,將洗脫液水浴40℃氮氣(N2)吹干。殘渣用流動相0.2 mL復溶,取20 μL供高效液相色譜(HPLC)分析。

1.8 色譜條件專屬性考察 采用“1.4”項色譜條件,分別考察標準溶液中CLT、內標溶液中地西泮及空白血漿的出峰時間。

1.9 血漿中CLT標準曲線的建立 精密吸取空白血漿0.25 mL,再精密加入CLT儲備液適量,按“1.7.2”項處理,制成含CLT濃度分別為10(低),25,50,100 (中),300,500(高)ng·mL-1線性標準溶液,高中低濃度各重復操作2管,取線性標準溶液20 μL進樣,測定樣品,記錄藥物及內標的峰面積,計算其峰面積比值(CLT/內標,R),以R對血漿濃度(C)進行線性回歸分析。

1.10 定量限與最低檢測限 分別以空白血漿定量稀釋某一濃度CLT線性溶液,按照“1.9”項操作,當信噪比約為10∶1時,連續進樣6次,若RSD≤10%,此濃度即為定量限;當信噪比為3∶1時,此時的濃度即為最低檢測限。

1.11 回收率實驗

1.11.1 相對回收率 分別配制含低、中、高濃度(10,100,500 ng·mL-1)CLT血漿樣品各5份,按“1.7.2”項處理,進樣20 μL作HPLC分析,將所得峰面積比代入回歸方程算得濃度,與標示濃度相比,即得相對回收率。

1.11.2 絕對回收率 分別配制低、中、高濃度含CLT血漿樣品各5份,按“1.7.2”項處理,進樣20 μL作HPLC分析,另用“1.7.2”項處理所得的空白血漿配制相應濃度CLT對照品溶液,直接進樣,記錄峰面積,將所得峰面積相比,即得絕對回收率。

1.12 精密度實驗

1.12.1 日內精密度 分別配制低、中、高濃度含CLT血漿樣品各5份,按“1.7.2”項處理,進樣20 μL作HPLC分析,記錄峰面積比,按回歸方程計算樣品濃度,計算日內精密度。

1.12.2 日間精密度 分別連續5 d配制低、中、高濃度含CLT血漿樣品各5份,按“1.7.2”項處理,進樣20 μL作HPLC分析,計算日間精密度。

1.13 樣品穩定性實驗

1.13.1 日內穩定性 分別配制低、中、高濃度含CLT血漿樣品各1份,按“1.7.2”項處理,常溫保存,在當天0,2,4,8,16,24 h分別進樣,計算日內穩定性。

1.13.2 冰凍穩定性 分別配制低、中、高濃度含CLT血漿樣品各6份,置于-20℃冰箱保存,分別在1,2, 4,8,16,24 d各取出一份,按“1.7.2”項處理進樣,計算冰凍穩定性。

1.13.3 凍融穩定性 分別按“1.7.2”項處理并配制低、中、高濃度的含CLT血漿樣品各5份,凍融3次后測定,計算回收率及RSD,考察其凍融穩定性。

1.14 藥動學

1.14.1 給藥方案與血樣采集 將12只SD大鼠隨機分成2組,每組6只,實驗前禁食12 h,自由飲水。按30 mg·kg-1劑量灌胃,按組分別依次給予CLTSMEDDS、CLT混懸液。分別于給藥后0.5,1,1.5,2, 3,4,6,8,12,24,36,48 h經眼眶取血0.5 mL,肝素抗凝,4 000 r·min-1離心10 min(半徑6 cm),分離血漿, -20℃冷凍保存供分析用。

1.14.2 血漿中藥物濃度數據處理與計算 用3P97實用藥動學計算程序(中國藥理學會數學藥理專業委員會編制),處理血藥濃度數據,計算藥動學參數,并用SPSS10.0版統計軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 方法可行性考察 在本實驗色譜條件下,CLT和內標分離完全,保留時間分別約為5.5和6.3 min,峰形良好,血漿中內源性物質不干擾測定,樣品中藥物的保留時間與標準品一致。CLT對照品及內標、空白血漿、給藥后血漿樣品色譜圖見圖1。

圖1 大鼠血漿CLT的HPLC圖

2.2 血漿標準曲線 以R對C進行線性回歸分析。線性回歸方程為:R=0.001 8C-0.006 7,r=0.999 6。結果表明,CLT血漿濃度在10～500 ng·mL-1范圍內,峰面積比值與血藥濃度線性關系良好。

2.3 回收率 見表1,2。血漿中相對回收率(96.55± 5.08)%～(97.90±2.87)%,絕對回收率＞80%,RSD均＜10%,能滿足方法學要求。

2.4 精密度 見表3。血漿樣品日內RSD和日間RSD均在1.67%～6.33%,表明精密度滿足方法學驗證要求。

2.5 樣品穩定性實驗結果 見表4～5。血漿樣品日內穩定性考察中濃度變化在97.12%～100.67%,冰凍穩定性考察中濃度變化在96.84%～100.10%,凍融穩定性考察回收率在96.70%～99.03%,符合方法學驗證要求。

2.6 定量限與最低檢測限 當信噪比為10時,定量限濃度為10 ng·mL-1,連續進樣6針的RSD為7.90%滿足≤10%的要求,當信噪比為3時,最低檢測限濃度為4 ng·mL-1。

表1 血漿中CLT相對回收率實驗結果 %,n=5

表2 血漿中CLT絕對回收率實驗結果 %,n=5

表3 CLT在血漿中的精密度實驗結果 %,n=5

表4 CLT日內穩定性實驗結果

表5 CLT冰凍穩定性實驗結果

2.7 藥動學研究 SD大鼠給藥后,測得平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

以3P97軟件計算,口服CLT-SMEDDS及CLT混懸液后,其藥動學主要參數見表7。

表6 CLT凍融穩定性實驗結果

3 討論

血漿中CLT的HPLC檢測,國內外已有報道[1,4]。本實驗中,筆者先后采用直接沉淀蛋白、液液萃取、固相萃取。采用直接沉淀蛋白法及液液萃取法處理后的樣品,內源性物質干擾仍然較嚴重,經實驗發現運用沉淀蛋白加固相萃取處理,能較好消除內源性物質的干擾,回收率高,且通過加入化學結構相近的內標的方法,避免了樣品處理過程操作引起的誤差,使結果更加具有重復性。固相萃取可以進行批量處理,比液-液萃取更快、更節省溶劑及時間,因此本方法簡單、快速、靈敏、準確,適合大鼠血漿中CLT藥動學研究。

圖2 CLT血藥濃度-時間曲線

表7 大鼠單劑量灌胃CLT-SMEDDS與CLT混懸液后藥動學參數 n=6,±s

表7 大鼠單劑量灌胃CLT-SMEDDS與CLT混懸液后藥動學參數 n=6,±s

與CLT混懸液比較,*1P＜0.01

藥物Cmax/ (ng·mL-1) tmax/ h AUC(0～48)/ (mg·mL-1·h) t1/2αt1/2βt1/2κα h kα/ h-1CLT混懸液181.22±12.773.62±0.512 173.08±242.352.56±0.3711.82±0.891.57±0.500.57±0.11 CLT-SMEDDS278.53±40.48*12.81±0.44*14 205.61±297.59*13.21±0.42*119.01±4.26*10.78±0.43*10.92±0.24*1

根據赤池信息量準則(Akaike information criterion, AIC)最小原則[5],CLT在體內的藥動學過程符合二室模型。結果表明,相同劑量CLT-SMEDDS口服后,達峰時間tmax較CLT混懸液提前1 h,AUC(0～48)較CLT明顯增加,且相對生物利用度(F)=(AUCSMEDDS/ DSMEDDS)/(AUC混懸劑/D混懸劑)×100%,結果為194%,表明CLT-SMEDDS在體內的起效快,吸收更好,生物利用度較普通制劑有更大提高。原因可能有以下幾點:①提高了藥物溶解度,改善了溶出;②SMEDDS所形成的平均粒徑較小,與小腸吸收部位的接觸面積相對較大;③SMEDDS中存在大量表面活性劑(一般占體系總量的20%～60%),其表面張力較低而易于通過胃腸壁的水化層,藥物能直接和胃腸上皮細胞接觸,增加對腸道上皮細胞的穿透性,促進藥物的吸收;④CLTSMEDDS遇水形成微乳液,且處方中含有長鏈脂肪酸IPM,可刺激乳糜微粒生成,促進淋巴轉運[6]。

另外,CLT-SMEDDS口服后消除半衰期(t1/2β)= (19.01±4.26)h,與CLT混懸劑組存在顯著差異,且較長,其可能是由于長鏈脂肪酸酯IPM或其代謝物肉豆蔻酸對胃的排空過程起抑制作用,使滯留時間延長[3]。檢測中,口服CLT混懸劑后,48 h不能從血漿中測出CLT,表明藥物幾乎從血液中完全消除,相對于CLTSMEDDS給藥后消除更快。

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.011

R978.1;R965

A

1004-0781(2014)07-0881-04

2013-07-18

2013-09-11

邱妍川(1982-),女,湖北荊門人,講師,碩士,主要研究方向:新劑型與新制劑。E-mail:christiana42@163. com。

朱照靜(1962-),男,重慶大足人,教授,博士,主要研究方向:新劑型與新制劑。E-mail:zhaojing6271@126. com。