硫化氫對缺氧誘導的大鼠皮層神經元損傷的保護作用*

魏楚蓉，劉路寬，田立兵，余艷貞，曾九江，白帥，毛慕華，文秀華，羅友根

(井岡山大學醫學院神經退行性疾病與衰老研究中心，江西吉安 343000)

硫化氫對缺氧誘導的大鼠皮層神經元損傷的保護作用*

魏楚蓉，劉路寬，田立兵，余艷貞，曾九江，白帥，毛慕華，文秀華，羅友根△

(井岡山大學醫學院神經退行性疾病與衰老研究中心，江西吉安 343000)

目的:探討硫化氫(H2S)對缺氧誘導的皮層神經元損傷的影響及作用機制。方法：將SD大鼠皮層神經元在2%O2、5%CO2、93%N2、37℃培養箱培養24 h，建立細胞缺氧模型。以硫氫化鈉(NaHS)作為H2S的供體，應用CCK-8分析細胞活性;采用熒光探針DCFH-DA檢測神經元活性氧(ROS)含量;用Rh123染色測定線粒體膜電位(MMP);采用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒分析神經元LDH釋放率，反映神經元的損傷情況。結果:(1)缺氧引起神經元ROS含量和LDH釋放率升高，NaHS預處理可抑制缺氧所致神經元ROS含量和LDH釋放率的升高; (2)缺氧降低神經元MMP和細胞活性，NaHS和活性氧清除劑NAC預處理均顯著抑制缺氧所致神經元MMP和細胞活性的降低。結論:缺氧增加神經元ROS含量，降低神經元MMP和細胞活性，而H2S通過其抗氧化作用，減輕缺氧所致神經元的損傷。

缺氧;神經元損傷;硫化氫;活性氧類

神經元凋亡是缺氧性疾病的主要病理改變之一，已成為影響神經系統疾病死亡率和致殘率的主要因素。研究表明自由基活動是缺氧誘導神經元損傷的一個重要機制［1-2］。低氧暴露，氧分壓迅速降低，引起細胞內活性氧快速增多，脂質過氧化，導致細胞凋亡［3］。

內源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)主要由半胱氨酸和同型半胱氨酸在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)和胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)作用下產生，在哺乳動物心血管、呼吸和神經系統中發揮著重要作用。近年來，研究發現H2S通過舒張血管［4］、調節神經突觸傳遞及抗氧化作用［5-6］等多種途徑，減少細胞損傷。而H2S在抑制缺氧誘導的神經細胞氧化應激反應中的作用機制還不夠明確。硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)在體內分解為Na+及HS-，后者與H+結合生成H2S，H2S和NaHS在體內形成動態平衡;因此，NaHS常被用來作為H2S的供體［7-8］。本研究采用原代培養皮層神經元，建立細胞缺氧模型;檢測細胞活性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放率，探討H2S對缺氧誘導神經元損傷的保護作用。

材料和方法

1 材料

NaHS、2＇，7＇-二氫二氯熒光素二乙酸酯(2＇，7＇-dichlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA)、L-多聚賴氨酸和xestospongin C(Xesto C)購自Sigma;Fura-2/AM、0.25%胰酶、Neurobasal和B27購自Invitrogen;阿糖胞苷購自Roche;胎牛血清和馬血清購自HyClone;LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所;CCK-8、Rh123和N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購自碧云天生物技術研究所;激光共聚焦皿購自無錫耐思生物科技有限公司;SD大鼠購自中山大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 細胞培養SD大鼠懷孕至17～19 d頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡1～2 min，取出胎鼠，游離出全腦，分離皮層，剪碎后用0.25%的胰蛋白酶37℃消化10 min，加含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化。1 000×g離心8 min，棄上清，細胞用種板液(含10%胎牛血清、10%馬血清、25 μmol/L L-谷氨酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養基)稀釋成1×109/L的密度，接種于經0.04 g/L L-多聚賴氨酸包被的共聚焦皿。在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后吸出培養液，換用Neurobasal+B27培養基，培養2 d后加入5 μmol/L阿糖胞苷以抑制膠質細胞的生長，每2 d進行半量換液1次。細胞培養7 d后用于下列實驗。

皮層神經元于2%O2、5%CO2、93%N2、37℃培養箱中培養復制缺氧模型。細胞缺氧前分別用50、100、200、300或600 μmol/L NaHS預處理30 min 和1 mmol/L NAC預處理60 min。

2.2 細胞活性檢測將神經元以1×104/well接種于96孔板，培養7 d后進行細胞活性檢測。各組細胞分別與CCK-8(每孔100 μL體積加10 μL CCK-8)孵育1.5 h，隨后采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。加相應量培養基和CCK-8溶液但沒有細胞的孔作為空白對照。按公式:細胞活性(%)=(實驗組A值-空白A值)/(對照組A值-空白A值)×100%，求出各組細胞活性。

2.3 神經元ROS測定DCFH-DA本身沒有熒光，穿過膜進入細胞后，在胞內酶的作用下轉變成DCFH。活性氧存在時，DCFH被氧化生成綠色熒光物質DCF，綠色熒光強度與細胞內活性氧水平呈正相關。因此，通過檢測細胞DCF的熒光強度反映細胞內ROS含量。

神經元處理后，用含5 μmol/L DCFH-DA的Neurobasal+B27培養基于37℃避光孵育50 min，細胞用EBSS(6 800 NaCl，400 KCl，264 CaCl2·2H2O，200 MgCl2·7H2O，2 200 NaHCO3，140 NaH2PO4· H2O，及1 000葡萄糖，單位:mg/L;pH 7.2)清洗3次。DCF熒光值采用TCS SP5激光共聚焦系統(Leica)進行檢測，隨機選取3個視野進行成像，重復3次，DCF平均熒光強度采用LAS AF 5.2.1.6757軟件進行分析。

2.4 神經元MMP測定Rh123是一種為線粒體所吸收的熒光染料，其吸收值隨MMP的改變而呈現相應的變化，從而改變細胞的熒光強度。因此，可通過檢測細胞Rh123的熒光強度反映細胞的MMP。神經元處理后，加入5 mg/L Rh123，避光于37℃孵育45 min，用激光共聚焦顯微鏡(激發波長488 nm，發射波長525 nm)隨機選取3個視野拍照，重復3次，以平均熒光強度表示MMP。

2.5 神經元LDH活性測定實驗方法參照試劑說明書。簡而言之，收集培養液0.1 mL，加人1 mL含70%乳酸鈉基質液和0.2 mg的輔酶I充分反應，在堿性條件下用2，4-二硝基苯肼顯色，在440 nm讀取吸光度。用同樣的方法測定相應細胞裂解液中總的LDH，用培養液中LDH活性與相應細胞LDH總活性的比值來表示LDH釋放率。

3 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 硫化氫抑制缺氧誘導的神經元活性的下降

缺氧處理24 h，神經元活性降至對照組的(52.5±3.3)%(P＜0.01)，而NaHS(100、200、300和600 μmol/L)孵育神經元30 min后再行缺氧處理，細胞活性分別升至對照組的(63.5±4.0)%、(66.5± 7.4)%、(71.8±9.7)%和(73.6±8.4)%，見圖1A。用不同濃度NaHS單獨處理神經元，與對照組相比，細胞活性差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖1B。上述數據表明，硫化氫抑制缺氧誘導的神經元活性的降低。

Figure 1.Inhibitory effect of H2S on the hypoxia-induced decrease in the viability of neurons.CCK-8 was employed to analysis the viability after cortical neurons were treated.A:the effect of H2S on the hypoxia-induced decrease in the viability of neurons; B:the effect of H2S on the viability of neurons.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 0 μmol/L NaHS+hypoxia.圖1 H2S對缺氧誘導的神經元活性下降的抑制作用

2 硫化氫對缺氧誘導的神經元ROS含量變化的影響

如圖2，缺氧24 h神經元DCF熒光值升高至48.1±12.5，為對照組(11.1±2.7)的4.4倍(P＜0.01)，而100 μmol/L和300 μmol/L NaHS預處理30 min后再缺氧處理，DCF熒光值分別降低至30.4±7.7和21.6±5.8，與缺氧組相比明顯降低(P＜0.01)，但仍高于對照組(P＜0.01)。單獨使用100 μmol/L和300 μmol/L NaHS處理神經元，DCF熒光值分別是10.6±2.5和10.6±2.4，與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。上述結果表明H2S顯著減少缺氧所致的神經元ROS含量的升高。

Figure 2.Effect of H2S on the hypoxia-induced variation of ROS content in neurons.The neurons were incubated with 5 μmol/L DCFH-DA for 50 min and then they were washed with EBSS.The fluorescent images were taken with a laser scanning confocal microscope and DCF fluorescent value was analyzed by LAS AF 5.2.1.6757 software.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control(without treatment);△P＜0.05;△△P＜0.01 vs hypoxia alone.圖2 H2S對缺氧誘導的神經元ROS含量變化的影響

3 硫化氫對缺氧誘導的神經元MMP變化的影響

MMP降低是細胞凋亡早期的重要特征之一。實驗采用1 mmol/L NAC清除缺氧產生的ROS。如圖3所示，缺氧組Rh123熒光值(10.6±2.1)顯著低于對照組(22.1±3.4;P＜0.01)。但用300 μmol/L NaHS或1 mmol/L NAC預處理后再行缺氧，Rh123熒光值分別回升到15.1±2.2和15.7±2.7，比缺氧組分別升高了(42.7±37.6)%和(49.0±35.6)%，但仍低于對照組(P＜0.01)。單獨用300 μmol/L NaHS或1 mmol/L NAC處理神經元，Rh123熒光值分別為22.9±3.9和23.0±4.7，與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。結合前面的結果提示，H2S通過清除活性氧從而抑制缺氧誘導的皮層神經元MMP的降低。

Figure 3.Effect of H2S on the hypoxia-induced change of MMP in neurons.The neurons were incubated with 5 mg/L Rh123 for 45 min at 37℃in the dark，and then three randomly selected fields were taken with a laser scanning confocal microscope.The fluorescence intensity was analyzed with LAS AF 5.2.1.6757 software.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control(without treatment);△△P＜0.01 vs hypoxia.圖3 H2S對缺氧誘導的神經元MMP變化的影響

4 硫化氫對缺氧誘導的神經元LDH釋放的影響

以缺氧組LDH釋放率作為100%，將其它各組LDH釋放率與之相比。如圖4所示，缺氧組LDH釋放率顯著高于對照組(P＜0.01)，而300 μmol/L NaHS或1 mmol/L NAC預處理后再缺氧，LDH釋放率分別降低至缺氧組的(66.1±8.0)%和(60.5± 10.6)%(P＜0.01)。單純使用NaHS或NAC處理神經元，LDH釋放率與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。上述結果表明，H2S通過清除活性氧減少缺氧誘導的神經元LDH的釋放。

討論

Figure 4.Effect of H2S on the hypoxia-induced LDH release in neurons.The commercial kit of LDH was used to analyze cell injury induced by hypoxia after neurons was treated.The LDH release rate was determined by LDH activity ratio between cell culture supernatant and cell lysate.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs control(without treatment);△△P＜0.01 vs hypoxia alone.圖4 H2S對缺氧誘導的神經元LDH釋放的影響

ROS介導細胞氧化應激在細胞損傷早期階段起著重要作用［9-10］。組織在缺氧環境下，能量代謝紊亂導致ROS產生增多;另一方面缺氧時抗氧化酶如過氧化物歧化酶、過氧化氫酶等的活性降低，ROS清除減少，隨后對細胞造成氧化應激損傷［11］。ROS促進DNA、RNA、脂質及蛋白質的氧化損傷，導致細胞結構破壞、功能障礙，甚至凋亡［12-13］。本研究發現H2S抑制缺氧時皮層神經元的ROS增多，發揮抗氧化能力，提高神經元的活性。

線粒體是細胞內氧化磷酸化和ATP生成的主要場所，能量代謝的過程中伴隨著ROS的產生［14］。因此，線粒體是細胞內ROS的主要來源地。同時線粒體又是氧化應激的主要靶點，對氧化應激損傷非常敏感［14-15］。過多ROS使線粒體膜通透性升高，細胞色素C釋放，引起線粒體膜結構和功能受損。線粒體內膜損傷直接導致膜通透小孔開放，MMP降低，多種凋亡因子釋放進入細胞質，這些是細胞凋亡啟動的關鍵因素［16］。本實驗結果顯示，H2S通過清除ROS阻止缺氧誘導的MMP下降，神經元活性顯著升高。

LDH釋放率被作為細胞膜是否完整的重要標準［17］。缺氧誘導ROS增多，引起細胞膜損傷，細胞內的酶類(如LDH)釋放到細胞外。因此，細胞培養基中LDH活性高低可以反映細胞損傷嚴重程度［18］。我們的實驗表明，缺氧誘導LDH釋放率升高，而H2S減少缺氧所致的LDH釋放，提高神經元活性。ROS清除劑NAC有相似的效果。

綜上所述，H2S的神經保護作用可能以線粒體為靶點，通過抑制缺氧誘導的ROS增多，維持MMP的穩定和減少LDH釋放率，減輕缺氧誘導神經元的損傷。然而缺氧誘導神經元損傷是一個多因素參與的復雜過程，需要更進一步地探討氣體信號分子H2S的潛在作用，以期為臨床治療相關疾病提供確切的理論指導。

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Protective effect of hydrogen sulfide on hypoxia-induced injury of rat cortical neurons

WEI Chu-rong，LIU Lu-kuan，TIAN Li-bing，YU Yan-zhen，ZENG Jiu-jiang，BAI Shuai，MAO Mu-hua，WEN Xiu-hua，LUO You-gen
(Research Center of Neurodegenerative Diseases and Aging，Medical College of Jinggangshan University，Ji’an 343000，China.E-mail:lyougen@163.com)

AIM:To explore the role of hydrogen sulfide(H2S)in cortial neuronal injury induced by hypoxia.METHODS:The SD rat cortical neurons were cultured in hypoxic conditions(2%O2，5%CO2and 93%N2at 37°C) to establish the hypoxic model.Sodium hydrosulfide(NaHS)was used as the donor of H2S and neuronal viability was detected by CCK-8 assay.Neuronal content of reactive oxygen species(ROS)was determined by DCFH-DA method，and mitochondrial membrane potential(MMP)was detected using Rh123 staining.Lactate dehydrogenase(LDH)release rate was measured by a commercial kit to reflect the degree of neuronal injury.RESULTS:Hypoxic treatment increased ROS content and the release rate of LDH in the neurons.However，NaHS pretreatment significantly inhibited the hypoxia-induced increases in ROS content and LDH release.Hypoxia decreased MMP and cell viability.Pretreatment with NaHS and N-acetyl-L-cysteine(NAC)，a ROS scavenger，significantly inhibited the decreases in MMP and viability of the neurons.CONCLUSION:Hypoxia induces ROS generation in the neurons，thereby decreases MMP and neuronal viability.H2S significantly attenuates hypoxia-induced neuronal injury by its antioxygenation.

Hypoxia;Neuronal injury;Hydrogen sulfide;Reactive oxygen species

Q421

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.002

1000-4718(2014)02-0203-05

2013-11-11

2013-12-08

國家自然科學基金資助項目(No.31360238);江西省自然科學基金資助項目(No.20132BAB205020);井岡山大學2013年度國家級大學生創新創業訓練計劃資助項目(No.2013001);吉安市科技支撐資助項目［No.(2012)32號10］;井岡

山大學自然科學科研項目(No.JZ1210)

△通訊作者Tel:0796-8117893;E-mail:lyougen@163.com