沉默JAG1基因對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響*

袁磊，李伯和，時冉冉，高麗，宋金玲，王建國

(漯河醫學高等專科學校分子生物學實驗室，河南漯河 462002)

沉默JAG1基因對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響*

袁磊，李伯和，時冉冉，高麗，宋金玲，王建國△

(漯河醫學高等專科學校分子生物學實驗室，河南漯河 462002)

目的:探究沉默Jagged 1(JAG1)基因對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響及其分子生物學機制。方法：用已構建的pRS-JAG1重組質粒轉染人乳腺癌MDA-MB-231細胞，采用Western blotting方法檢測重組質粒對JAG1蛋白表達的影響;MTT比色法測定沉默JAG1對細胞生長的抑制情況;流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡;蛋白印記分析細胞周期蛋白1(cyclin D1)、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p-Rb、Bcl-2、Bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的變化。結果:Western blotting結果證實重組質粒可在72h內有效抑制JAG1蛋白表達;人乳腺癌MDA-MB-231細胞JAG1被沉默后，細胞的生長速度明顯減慢，細胞明顯阻滯于G0/G1期，細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，cyclin D1、p-Rb、Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平被下調(P＜0.05)，而p21CIP1/WAF1、p27KIP1、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高(P＜0.05)。結論:沉默JAG1可有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，并誘導其凋亡。本研究為以JAG1為分子靶點的三陰乳腺癌治療提供實驗依據。

JAG1蛋白;短發夾RNA;細胞周期;細胞凋亡;MDA-MB-231細胞

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來發病率和死亡率明顯上升，并趨于年輕化。盡管手術治療和術后多種輔助治療對患者的預后有明顯的改善，但是乳腺癌仍具有較高的復發率和死亡率［1］。Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用調控胚胎發育、血管發生、程序性細胞死亡和細胞增殖等多種生理過程［2-5］，在腫瘤的侵襲、轉移、凋亡、增殖和血管生成等病理過程中也發揮著關鍵作用［6-7］。

Notch信號途徑的激活始于Notch受體胞外區與相鄰細胞表面的Notch配體胞外區的結合，哺乳動物有4種Notch受體(Notch1～4)和5種Notch配體(Delta-like ligand，DLL1，3，4和Jagged，JAG1，2)。在乳腺癌細胞系中，MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、ZR-75-1、T47D和SKBR3等細胞均不表達DLL3、DLL4和Notch4，只有MDA-MB-231細胞不表達Notch3，MDA-MB-468和SKBR3細胞不表達JAG2，MCF-7、ZR-75-1和T47D細胞表達DLL1，JAG1在MDA-MB-231細胞中表達較強［8］。

O＇Neill等［9］的研究發現Notch2信號通路可抑制MDA-MB-231細胞增殖并促進細胞凋亡。我們前期研究發現沉默Notch1基因可促進MCF-7細胞凋亡［10］。為進一步探討Notch配體在細胞增殖和凋亡中的作用及其作為分子靶點用于乳腺癌治療的潛在價值，本研究通過沉默JAG1表達，在體外觀察其對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖與凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231細胞由本實驗室保存;重組質粒pRS-JAG1由本實驗室前期構建;胎牛血清和RPMI-1640培養基購自Gibco;質粒提取試劑盒購自北京天根公司;脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen;JAG1、cyclin D1、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p-Rb (Ser807/811)、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin抗體和HRP標記山羊抗兔IgG購自Santa Cruz;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen。

2 方法

2.1 細胞培養用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養MDA-MB-231細胞，觀察細胞生長情況，每2～3 d用胰酶消化，傳代培養。

2.2 重組質粒轉染當細胞匯合度達80%以上時換為無血清培養基，使用Lipofectamine 2000將構建好的重組質粒pRS-JAG1和pRS-scrambled分別轉染MDA-MB-231細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中培養6 h后用PBS洗去轉染試劑，換成正常培養基繼續培養。實驗分組:(1)control組:轉染重組質粒pRS-scrambled的MDA-MB-231細胞;(2)shJAG1組:轉染重組質粒pRS-JAG1的MDA-MB-231細胞。

2.3 MTT檢測細胞增殖取對數生長期細胞，調成密度為5×107/L的細胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，同時設空白對照孔。分別在1 d、2 d、3 d和4 d后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37℃培養4 h后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min溶解結晶，酶標儀檢測490 nm波長吸光度A值。每組設5個復孔，實驗重復3次。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡重組質粒轉染72 h后，制備各實驗組細胞懸液，用PBS洗滌細胞2次，取約5×105個細胞重懸于200 μL 1×binding buffer，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μL 1×binding buffer，流式細胞術檢測細胞凋亡。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期重組質粒轉染72 h后，制備各實驗組細胞懸液，用冷PBS洗滌細胞2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4℃固定24 h，離心去除乙醇，再用冷PBS洗滌細胞2次，加入1 mL PI溶液(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，流式細胞術檢測。

2.6 Western blotting檢測蛋白水平重組質粒轉染72 h后，裂解各組細胞提取總蛋白，用BCA法定量后，進行SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜。封閉液(5%BSA/TBST)封閉1 h，加入Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發光反應，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印記，運用ImageJ軟件測定各蛋白條帶灰度值。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 特異性shRNA抑制MDA-MB-231細胞JAG1蛋白表達

Western blotting結果顯示，MDA-MB-231細胞在轉染重組質粒pRS-JAG1后的1～3 d，JAG1/β-actin灰度比分別為0.0820±0.0437、0.0517±0.0216和0.0323±0.0114，均顯著低于control組(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Expression of JAG1 protein in human breast cancer MDA-MB-231 cells after pRS-scrambled/pRS-JAG1 transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖1 pRS-scrambled/pRS-JAG1轉染MDA-MB-231細胞后JAG1蛋白表達

2 沉默JAG1抑制MDA-MB-231細胞生長

用MTT法檢測1～3 d細胞的生長狀況，發現轉染重組質粒pRS-JAG1的細胞生長減慢，第3天A值顯著低于control組(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of JAG1 silencing on the growth of MDA-MB-231 cells detected by MTT assay.Mean±SD.n= 5.*P＜0.05 vs control group.圖2 MTT法檢測沉默JAG1對MDA-MB-231細胞生長的影響

3 沉默JAG1對MDA-MB-231細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，shJAG1組G0/G1期細胞比例為(80.47%±2.02)%，顯著高于control組(P＜0.05)，S期和G2/M細胞比例分別為(8.51% ±1.15)%和(11.01%±0.88)%，均顯著低于control組(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effect of JAG1 silencing on cell cycle of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖3 流式細胞術檢測沉默JAG1對MDA-MB-231細胞周期的影響

4 沉默JAG1對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，shJAG1組MDA-MB-231細胞凋亡率為(17.45%±2.21)%，顯著高于control 組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.Effect of JAG1 silencing on apoptosis of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 流式細胞術檢測沉默JAG1對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

5 沉默JAG1對cyclin D1、p21CIP1/WAF1、p27KIP1和p-Rb蛋白水平的影響

shJAG1組p21CIP1/WAF1/β-actin和p27KIP1/β-actin的灰度比分別為0.5396±0.0516和0.8092± 0.0762，均顯著高于control組(P＜0.05)，而cyclin D1/β-actin和p-Rb/β-actin的灰度比分別為0.2801 ±0.0309和0.4439±0.0472，均顯著低于control組(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Effects of JAG1 silencing on the protein levels of cyclin D1，p21CIP1/WAF1，p27KIP1and p-Rb in MDA-MB-231 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖5 沉默JAG1對cyclin D1、p21CIP1/WAF1、p27KIP1和p-Rb蛋白水平的影響

6 沉默JAG1對Bcl-2、Bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

shJAG1組Bcl-2/β-actin和Bcl-xL/β-actin的灰度比分別為0.3434±0.0325和0.4041±0.0527，均顯著低于control組(P＜0.05)，而Bax/β-actin和cleaved caspase-3/β-actin的灰度比分別為0.7790± 0.0623和0.7994±0.0887，均顯著高于control組(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6.Effects of JAG1 silencing on phosphorylation of Bcl-2，Bax，Bcl-xL and cleaved caspase-3 in MDA-MB-231 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖6 沉默JAG1對Bcl-2、bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

討論

三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是以雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)、孕酮受體2(progesterone receptor 2，PR)和人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER-2)均不表達為特點的乳腺癌細胞［11］，占所有乳腺癌細胞的10%～15%［12-14］，由于缺乏針對這些受體的有效治療靶點，無法采用內分泌治療和曲妥單抗治療，導致預后較差［15］。于是化療就成為治療此類乳腺癌的主要方法，但存在療效不穩定，副作用大以及多藥耐藥等問題，因此，急需找到針對TNBC的有效的分子治療靶點。

Notch信號通路與TNBC關系密切［16］，以Notch信號通路為靶向的γ分泌酶抑制劑(γ secretase inhibitors，GSI)將有可能改善TNBC患者的預后，但其所帶來的各種副作用會限制GSI的使用［17］。本研究選取人乳腺癌MDA-MB-231細胞作為TNBC的代表，以Notch配體JAG1為靶點，采用shRAN干擾技術沉默JAG1，發現沉默JAG1可有效抑制MDA-MB-231細胞生長。

細胞生長是細胞增殖和細胞凋亡相互協調的結果，而細胞增殖是通過細胞周期來完成的。細胞周期是多因子參與的高度精確和有組織的時序調控過程。細胞周期素、細胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)和細胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)是細胞周期調控中的關鍵組分。細胞周期素D1(cyclin D1)和細胞周期素E(cyclin E)屬細胞周期素家族成員，可分別與CDK4和CDK2結合并激活其活性，調控細胞由G1期至S期的轉變。視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)是cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2激酶的一種重要底物。高度磷酸化的Rb與E2F轉錄因子解離，使E2F得以活化，從而激活一系列下游事件，其中包括DNA的復制，使細胞從G1期進入S期。p27KIP1和p21CIP1/WAF1等是CDKIs中的重要成員，可與G1期激酶復合物如cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2等緊密結合，抑制這些激酶復合物對Rb的磷酸化，阻止細胞從G1期進入S期。

本研究發現，沉默JAG1可顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞cyclin D1的表達，同時促進人乳腺癌MDA-MB-231細胞p21CIP1/WAF1和p27KIP1蛋白表達，從而抑制Rb磷酸化，進而阻止人乳腺癌MDAMB-231細胞從G1期進入S期。

在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起著至關重要的作用。Bcl-2家族可以分為兩大類，一類是抗凋亡的，主要有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等，另一類是促細胞死亡的，主要包括Bax、Bak、Bad、Bid等。本研究發現，沉默JAG1可顯著下調人乳腺癌MDAMB-231細胞Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達，上調Bax蛋白表達。Bax可插入線粒體外膜并寡聚成孔道，也可與線粒體外膜中的電壓依賴性陰離子通道(voltagedependent anion channel，VDAC)結合引起線粒體通透性轉變孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的持續開放，進而引起線粒體外膜通透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)和線粒體膜電位消散，釋放線粒體膜間腔中的促凋亡蛋白，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)，最終導致細胞凋亡［18-19］。

綜上所訴，由于Notch1和Notch2在人乳腺癌MDA-MB-231細胞發揮著相反的作用［9，20］，高表達的Notch配體JAG1可能通過與Notch1結合，促進MDA-MB-231細胞增殖并抑制細胞凋亡。因此，JAG1-Notch1信號通路有望成為針對TNBC的有效的分子治療靶點。

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Effects of JAG1 gene silencing on proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells

YUAN Lei，LI Bo-he，SHI Ran-ran，GAO Li，SONG Jin-ling，WANG Jian-guo
(Laboratory of Molecular Biology，Luohe Medical College，Luohe 462002，China.E-mail:wr0395@sina.com)

AIM:To investigate the effects of Jagged 1(JAG1)gene silencing on the proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells.METHODS:The specific recombinant vector pRS-JAG1 was transfected into MDA-MB-231 cells with lipofectamine.The protein expression of JAG1 was observed by Western blotting after transfection.MTT assay was used to detect the effect of JAG1 gene silencing on the growth of the cells.The apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.The protein levels of cyclin D1，p21CIP1/WAF1，p27KIP1，p-Rb，Bcl-2，Bax，Bcl-xL and cleaved caspase-3 were determined by Western blotting.RESULTS:Compared with control group，the expression level of JAG1 was reduced by pRS-JAG1 transfection for 72 h(P＜0.05).The growth of MDA-MB-231 cells in shJAG1 group was significantly inhibited(P＜0.05).The percentages of G0/G1-phase cells and early apoptotic rate were obviously higher in shJAG1 group than those in control group(P＜0.05).The shRNA-mediated JAG1 silencing decreased the protein levels of cyclin D1，p-Rb，Bcl-2 and Bax，and increased the protein levels of p21CIP1/WAF1，p27KIP1，Bax and cleaved caspase-3(P＜0.05).CONCLUSION:JAG1 silencing effectively inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human breast cancer cells，suggesting that JAG1 might serve as a therapeutic target for triple-negative breast cancer.

JAG1 protein;Short hairpin RNA;Cell cycle;Apoptosis;MDA-MB-231 cells

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.012

1000-4718(2014)02-0262-06

2013-10-31

2013-12-20

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(No.122300410277);漯河醫學高等專科學校科研基金資助項目(No.2010-S10)

△通訊作者Tel:0395-2112681;E-mail:wr0395@sina.com