5型腺病毒載體對人T淋巴細胞的轉染及細胞毒性分析*

張文峰，張瓊宇，邵紅偉，吳鳳麟，王騰，黃樹林△

(1廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，2廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006;3永州職業技術學院基礎醫學部，湖南永州 425100)

·短篇論著·

5型腺病毒載體對人T淋巴細胞的轉染及細胞毒性分析*

張文峰1，2，張瓊宇3，邵紅偉1，2，吳鳳麟1，2，王騰1，2，黃樹林1，2△

(1廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，2廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006;3永州職業技術學院基礎醫學部，湖南永州 425100)

目的:利用5型腺病毒載體轉染人T淋巴細胞，對其轉染T淋巴細胞的效率以及細胞毒性進行分析。方法：選取T淋巴瘤Jurkat細胞及原代T細胞，腺病毒按感染復數(multiplicity of infection，MOI)為20、50、100、200和400對其轉染，轉染48 h后利用流式細胞術檢測轉染效率;選取腺病毒轉染后的不同時點，利用碘化丙啶染色法分析轉染對于細胞周期的影響;利用Annexin V/7-AAD染色法分析轉染誘導細胞凋亡情況;利用臺盼藍染色計數法分析轉染對活細胞數目的影響。結果:5型腺病毒載體轉染T淋巴瘤的效率最高，轉染效率隨著MOI值的增大而增加;CD8+T細胞和CD4+T細胞的轉染效率大致相同，T細胞經刺激活化后，CD8+T細胞的轉染效率下降;病毒轉染未導致明顯細胞凋亡;病毒轉染對細胞周期與活細胞數目沒有顯著影響。結論:5型腺病毒載體轉染T細胞呈現較低細胞毒性。

腺病毒載體;T淋巴細胞;細胞毒性

T細胞通過膜表面的T細胞受體(T-cell receptor，TCR)發揮抗原識別作用［1-2］。利用抗原特異性TCR基因修飾T細胞進行過繼性移植/回輸，在抑制腫瘤生長、控制病毒感染等方面具有良好的前景［3-4］。腺病毒載體因具有能感染增殖和非增殖細胞、無插入致突變性、能同時表達多個外源基因等優點，是基因治療中的理想載體工具，有望在TCR基因修飾T細胞治療中發揮重要作用。

目前主要使用的腺病毒載體為血清型5型腺病毒(adenovirus serotype 5，Ad5)載體，本實驗利用Ad5轉染人T淋巴瘤Jurkat細胞及原代T細胞，確定其轉染效率;并在轉染后的各個不同時點進行細胞周期、細胞凋亡和活細胞數目檢測，評價Ad5轉染的細胞毒性，為進一步研究腺病毒載體在TCR基因修飾T細胞的過繼性治療的臨床應用奠定基礎。

材料和方法

1 材料

Jurkat細胞為本實驗室保存，腺病毒穿梭載體pDC315與骨架載體pBHGloxΔE1，3Cre購自Microbix。淋巴細胞分離液購自灝洋生物制劑技術公司，AIM-V無血清培養基和無血清RPMI-1640培養基購自Gibco，胰蛋白酶購自Amresco，胎牛血清購自Gibco，propidium iodide購自TaKaRa，流式細胞術檢測抗體CD8-PE、CD4-PE-Cy5和Annexin V/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自Ebioscience，Trypan blue購自廣州威佳生物公司，CO2細胞培養箱購自Thermo，Coulter Elite流式細胞儀購自貝克曼公司。

2 方法

2.1 淋巴細胞的分離和培養取健康人外周血，Ficoll-Hapaque密度梯度離心法分離健康供血者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用RPMI-1640將細胞調至2×109/L。移至培養瓶中豎立培養(20 mL/瓶)，再加入10%胎牛血清和2×104IU/L白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)，37℃培養。

2.2 病毒轉染分離的PBMC以1×109cells/L在AIM-V無血清培養基中培養72 h，細胞刺激活化組則在培養基中補加有終濃度6×105IU/L IL-2和10 μg/L anti-CD3抗體;1 000×g離心5 min，棄上清，AIM-V無血清培養基重懸細胞為1×109cells/L，接種至12孔細胞培養板中，按不同感染復數(multiplicity of infection，MOI)加入腺病毒并置于細胞培養箱中培養12 h;1 000×g離心5 min，棄上清，加入新鮮AIM-V無血清培養基繼續培養至不同時點。

2.3 細胞周期的測定取腺病毒轉染后不同時點的T細胞，800×g離心10 min棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min棄上清;加0.5 mL PBS吹勻;用5 mL注射器將細胞吸起，用力打入5 mL 70%預冷乙醇中，4℃固定過夜;800×g離心15 min收集固定細胞，PBS洗2次;用0.4 mL PBS重懸細胞并轉至tube中輕輕吹打;加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 mg/L，37℃水浴消化30 min;加PI約50 μL至終濃度約為65 mg/L，在冰浴中避光染色30 min;經尼龍網過濾，上流式細胞儀檢測。

2.4 細胞凋亡的檢測取腺病毒轉染后不同時點的Jurkat細胞，800×g離心10 min，棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min，棄上清;加2 mL結合緩沖液重懸細胞，800×g離心10 min，棄上清;加100 μL結合緩沖液重懸細胞，隨后加入5 μL Annexin V-PE，室溫避光孵育15 min;加入2 mL結合緩沖液重懸細胞，800×g離心10 min，棄上清;加500 μL結合緩沖液重懸細胞，隨后加入5 μL 7-AAD，上流式細胞儀檢測。

2.5 細胞計數選取生長狀態良好的Jurkat細胞接種于12孔細胞培養板，每孔5×105細胞，按所選MOI值加入腺病毒，未經病毒轉染組為對照組;放置37℃培養48 h和72 h后，經臺盼藍染色后計數活細胞數目，取4個孔的均值。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用方差分析(ANOVA)對組間差異進行顯著性檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 Ad5針對T細胞的轉染效率

Ad5-GFP轉染各種T細胞48 h后的效率見圖1。在MOI值相同時，Ad5-GFP對T淋巴瘤細胞的轉染效率最高，并且隨著MOI值的升高，轉染效率隨之增加;當MOI為400時，大約60%的細胞表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。Ad5-GFP對原代CD8+T細胞和CD4+T細胞的轉染能力大致相當，轉染效率并未隨MOI值的升高而顯著增加;在MOI為400時，約15%的CD8+T細胞和約13%的CD4+T細胞表達GFP。當外周血T細胞預先用CD3抗體和IL-2、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等細胞因子刺激活化后，CD8+T細胞和CD4+T細胞所占比例有所提高，CD8+T為50%，CD4+T為32%(結果未顯示)，在MOI為400時，約9%的CD4+T細胞被成功轉染;經刺激活化后，Ad5-GFP針對CD8+T細胞的轉染效率明顯下降，在MOI為400時，僅4%的CD8+T細胞被轉染。

Figure 1.The Ad5 transfection efficiencies for T cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs MOI 20 group.圖1 Ad5針對T淋巴細胞轉染效率結果

2 Ad5轉染T細胞誘導細胞凋亡情況

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)位于細胞膜磷脂雙分子層的內側，當細胞發生早期凋亡時，PS會發生外翻到細胞膜脂雙層外側，外翻的PS會被Annexin V結合，而染料7-AAD無法通過細胞膜而進入到細胞內部，Annexin V+/7-AAD-細胞即為早期凋亡細胞;細胞發生晚期凋亡時，染料7-AAD會穿過凋亡細胞膜上小孔進入細胞內部，Annexin V+/7-AAD+細胞即為晚期凋亡細胞。Ad5-GFP轉染Jurkat細胞后不同時點，利用Annexin V-PE/7-AAD檢測細胞凋亡情況，如圖2所示，相比未發生病毒轉染的對照組細胞，病毒轉染后早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞所占的比例均沒有出現明顯增加。圖2中還列出了病毒轉染后細胞結合染料Annexin V-PE的平均熒光強度(mean fluorescent intensity，MFI)，該值反映出每個細胞所結合染料Annexin V的情況，細胞膜上發生外翻的PS越多，其MFI值就越大。在病毒轉染后的相同時點，隨著病毒MOI值的增加，其MFI值出現遞減的趨勢。MFI值的減少也許與腺病毒通過細胞胞吞方式進入細胞內有關。

3 Ad5轉染T細胞對細胞增殖能力的影響

經不同MOI值轉染的Jurkat細胞，被植物血凝素刺激不同時間(48 h和72 h)后活細胞數目的變化情況見圖3。隨著刺激時間增加，所選MOI值轉染條件下的細胞數目均有增加;在同一刺激時段，與未發生病毒轉染的對照組相比較，各MOI值轉染條件下的細胞數目未發現明顯下降，表明Jurkat細胞在被腺病毒轉染后，對外界刺激所具有的增殖能力并未受到影響。

4 Ad5轉染T細胞對細胞周期影響

在病毒轉染T細胞后48 h和72 h，相對于未發生病毒轉染的陰性對照組細胞，處于G0/G1期、S期和G2/M期的細胞比例未見明顯變化，沒有出現細胞周期阻滯于某個時期，見表1。

討論

Ad5利用病毒纖毛頭節區結合細胞膜表面的柯薩奇-腺病毒受體(coxsackie-adenovirus receptor，CAR)完成病毒與靶細胞的吸附，然后通過病毒纖毛基底部五鄰體與靶細胞膜表面的整合素相互作用內化到細胞中并進入溶酶體，最后腺病毒顆粒轉位到細胞核，通過核孔將病毒DNA釋放到細胞核內［5］。本實驗發現Ad5-GFP轉染Jurkat細胞的效率明顯高于原代T淋巴細胞，也許和Jurkat細胞表面的CAR與整合素的表達有關;抗體和細胞因子刺激活化后的CD8+T細胞表現出更難以被Ad5-GFP轉染，或許是刺激活化導致細胞CAR與整合素的表達水平發生變化，也可能與病毒顆粒在細胞內的運輸效率有關［6］，有關Ad5在T細胞中運輸的分子機制有待進一步研究。

Figure 2.The apoptosis of Jurkat cells after Ad5 transfection detected by flow cytometry and Annexin V/7-AAD staining.Mean±SD.n=3.MFI:mean fluorescent intensity.圖2 Ad5轉染Jurkat細胞后不同時點細胞凋亡檢測結果

在本實驗所選擇的MOI值條件下，磷脂酰絲氨酸外翻細胞的所占比例未顯著提高，未發現Ad5轉染導致T細胞的顯著凋亡。實驗中發現病毒MOI值的增加導致單個細胞上磷脂酰絲氨酸外翻數目減少的現象，可能與腺病毒誘導細胞胞吞進入細胞的方式有關。以往研究結果表明膽固醇在腺病毒的胞吞過程中發揮重要作用［7］，磷脂酰絲氨酸是否在腺病毒的胞吞過程中起到重要作用以及具體參與方式等問題，有待進一步的研究。

逆轉錄病毒載體以及慢病毒載體是目前基因治療中最常用的2種病毒載體，但由于其滴度偏低、可能在淋巴細胞基因組內隨機插入產生致瘤的風險，因此并不是TCR基因修飾T細胞過繼性治療中的理想載體［8］。本研究對Ad5轉染T淋巴細胞的效率以及細胞毒性進行了初步的分析，發現Ad5轉染原代T淋巴細胞的效率偏低，以往研究結果表明增加病毒轉染的MOI值將會有效提高病毒轉染靶細胞的能力［9］，因此可以采用提高MOI值的方法提高Ad5轉染原代T細胞的效率;在細胞周期檢測中，未發現Ad5轉染引起細胞周期阻滯;在活細胞計數的實驗中，T細胞對刺激的活化增殖能力未受到Ad5轉染的影響，表明Ad5介導轉染T細胞的低細胞毒性。綜上所述，Ad5腺病毒載體是TCR基因治療的一種合適載體，在以后的臨床應用中具有廣闊的前景。

Figure 3.The effects of transfection with Ad5 on the proliferation of Jurkat cells.Mean±SD.n=5.圖3 Ad5轉染Jurkat細胞后不同時點細胞計數結果

表1 Ad5轉染T細胞后不同時點細胞周期分析結果Table 1.The effects of transfection with Ad5 on the cell cycle of T lymphocytes(Mean±SD.n=3)

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Transfection efficiency and cytotoxicity in human T lymphocytes infected with Ad5 adenoviral vector

ZHANG Wen-feng1，2，ZHANG Qiong-yu3，SHAO Hong-wei1，2，WU Feng-lin1，2，WANG Teng1，2，HUANG Shu-lin1，2
(1School of Life Science＆Biopharmacology，2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology Candidate Drug Research，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;3Department of Basic Medical Science，Yongzhou Vocational Technical College，Yongzhou 425100，China.E-mail:shulhuang@sina.com)

AIM:To determine the transfection efficiencies and to evaluate the cytotoxicity of infection with Ad5 adenoviral vector in human T lymphocytes.METHODS:The T-lymphoma Jurkat cell line，normal CD3+T cells and pre-stimulated CD3+T cells were transfected with Ad5 adenovirus at multiplicities of infection(MOI)ranging from 20 to 400.GFP expression was analyzed by flow cytometry 48 h after transfection.The cells were harvested 24 h，48 h and 72 h after transfection.The cell cycle was analyzed using propidium iodide staining and the apoptosis of T lymphocytes was detected by annexin V/7-AAD staining.Trypan blue exclusion assay was used to determine the survival cell numbers after 48 h or 72 h of transfection.RESULTS:The transfection of primary human T cells by the Ad5 virus was less efficient than that of a T-lymphoma cell line.Similar transfection efficiency was observed in both CD4+T lymphocytes and CD8+T lymphocytes.The activation of T lymphocytes resulted in a decrease in Ad5 transfection efficiency in CD8+T cells.Following transfection(24 h，48 h and 72 h)，the percentages of G0/G1-phase cells，S-phase cells，G2/M-phase cells and apoptotic cells at all MOI did not change significantly.Therefore，transfection by the Ad5 adenoviral vector did not influence the cell cycle and survival cell numbers.CONCLUSION:The Ad5 adenoviral vector，which shows little cytotoxicity to T lymphocytes，may be a valuable tool for T cell receptor gene therapy.

Adenoviral vector;T lymphocytes;Cytotoxicity

1000-4718(2014)02-0318-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.022

2013-09-05

2013-12-23

科技部“重大新藥創制”科技重大專項“十一五”計劃項目(No.2009ZX09103-708);國家自然科學基金資助項目(No.31100664;No.31300737;No.81303292);東莞市科技計劃項目(No.2011105102027)

△通訊作者Tel:020-39352201;E-mail:shulhuang@sina.com