霧化吸入滅活草分枝桿菌降低哮喘小鼠核因子κB及細胞間黏附分子1的表達*

呂盛秋，李超乾，明莫瑜，羅智熹

(廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸內科，廣西南寧 530021)

霧化吸入滅活草分枝桿菌降低哮喘小鼠核因子κB及細胞間黏附分子1的表達*

呂盛秋，李超乾△，明莫瑜，羅智熹

(廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸內科，廣西南寧 530021)

目的:研究霧化吸入滅活草分枝桿菌對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥，以及哮喘肺組織中核因子κB (NF-κB)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子1(VCAM-1)的影響，探討霧化吸入滅活草分枝桿菌防治哮喘的機制。方法：將24只雄性BALB/c小鼠按隨機數字表法分為3組，每組8只:正常對照組(A)、哮喘模型組(B)和治療組(C)。以雞卵清蛋白致敏制造小鼠支氣管哮喘模型。C組在激發后給予霧化吸入滅活草分枝桿菌治療5 d，每天1次。各組動物處死后提取肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)。進行病理HE染色及AB-PAS染色觀察氣道炎癥浸潤及黏液分泌情況，并行病理半定量分析。對BALF中炎癥細胞進行分類計數。實時熒光定量PCR檢測肺組織NF-κB、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達水平。結果:治療組嗜酸性粒細胞比例低于模型組(P ＜0.05)，氣道炎癥病變及黏液分泌情況較模型組減輕(P＜0.05，P＜0.01)。哮喘模型組的肺組織中NF-κB mRNA含量與正常組相比顯著升高(P＜0.01)，而治療組肺組織中的NF-κB mRNA含量明顯低于模型組(P＜0.05);模型組的ICAM-1 mRNA水平比正常組高(P＜0.05)，但治療后明顯降低(P＜0.01);VCAM-1的mRNA水平在各組間無顯著差異。相關性檢驗發現小鼠肺組織中VCAM-1的mRNA與ICAM-1的mRNA呈明顯正相關(r=0.84，P ＜0.01)，但NF-κB的mRNA與ICAM-1的mRNA、VCAM-1的mRNA無明顯相關性(均P＞0.05)。結論:霧化吸入草分枝桿菌對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥及黏液分泌有抑制作用;NF-κB參與哮喘發病過程，霧化吸入滅活草分枝桿菌降低哮喘小鼠的NF-κB水平。同時霧化吸入滅活草分枝桿菌可降低黏附分子尤其是ICAM-1的表達，是其控制炎癥的另一個重要機制。

哮喘;滅活草分枝桿菌;NF-κB;細胞黏附分子

支氣管哮喘是全球一個主要衛生問題。隨著它的發病率和死亡率上升，糖皮質激素治療支氣管哮喘應用日益廣泛，經常引起許多副作用，有必要開發具有更高療效和更少副作用的新藥。我們之前的研究發現滅活草分枝桿菌作為免疫調節劑能減輕支氣管哮喘氣道炎癥，霧化吸入滅活草分枝桿菌可能作為一種方便安全、副作用少的支氣管哮喘治療方法［1］。而關于霧化吸入滅活草分枝桿菌治療支氣管哮喘的機制的研究仍在進行。

核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種調控基因表達的DNA結合蛋白，它位于Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)下游信號通路的樞紐位置，可通過調控細胞因子和黏附分子基因的表達，參與機體的各種炎癥和免疫反應［2］。動物實驗已證實TLR4/NF-κB可能參與哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重構［3］，滅活草分枝桿菌可通過上調TLR2和TLR4的表達調節支氣管哮喘的免疫失衡［4-5］。由此我們猜測位于下游的NF-κB亦會參與滅活草分枝桿菌治療支氣管哮喘的過程。而細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)參與調節炎癥反應、免疫應答反應，是被研究最多的黏附分子。有報道稱炎癥細胞浸潤主要是通過黏附分子的表達使白細胞向上皮細胞黏附增強所致［6］。肺氣道上皮黏附分子如ICAM-1和VCAM-1上調常伴有炎癥細胞浸潤，是各種氣道炎癥性疾病發病機制的關鍵［7］。黏附分子的表達與NF-κB的活化有何關系?霧化吸入滅活草分枝桿菌是否可以降低哮喘肺組織中黏附分子的表達?是否通過NF-κB信號通路來降低哮喘小鼠肺組織中的ICAM-1和VCAM-1從而減輕哮喘炎癥及黏液分泌?本實驗擬通過檢測哮喘小鼠肺組織中NF-κB、ICAM-1和VCAM-1的表達及霧化吸入滅活草分枝桿菌對其表達的影響，為闡明霧化吸入滅活草分枝桿菌治療支氣管哮喘的作用機制提供依據。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

雞卵清蛋白(ovalbumin，OVA;Sigma)，氫氧化鋁粉(分析純，成都科龍化工試劑廠)，草分枝桿菌F. U.36注射液(成都金星健康藥業有限公司)，瑞氏染色液，病理圖像分析系統(Leica)，Trizol Reagent(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(Invitrogen)，NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和β-actin引物(上海生工公司)，SYBR qPCR Mix(Toyobo)，real-time PCR儀(Applied Biosystems)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(Nano-Drop)，高速低溫離心機(Eppendorf 5810R)，超聲霧化器WH-2000(廣東粵華醫療器械廠)，自制霧化吸入箱。1%戊巴比妥鈉、10%甲醛、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered solution，PBS)等。

2 方法

2.1 小鼠支氣管哮喘模型制作及分組健康雄性SPF級BALB/c小鼠，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，鼠齡6～8周，體重18～22 g，隨機數字表法分為正常對照組(A組)、哮喘模型組(B組)和治療組(C組)，每組8只。模型組和治療組均給予OVA制作小鼠哮喘模型;治療組在造模成功后給予滅活草分枝桿菌霧化吸入，具體方法是:用OVA行腹腔注射致敏和霧化吸入激發建立哮喘模型，參照文獻［8］略有改進，每只小鼠腹腔注射25 μg OVA和1 mg氫氧化鋁(混合于0.2 mL PBS中)，于第1天、第8天和第15天分別注射。OVA致敏后，于第22天開始激發，將小鼠置于自制20 cm×30 cm×20 cm密閉容器中，給予2%OVA·PBS 20 mL霧化吸入刺激，每天1次，每次20 min，連續7 d。正常對照組以PBS代替致敏原注射和霧吸刺激。治療組在激發第7天后給予滅活草分枝桿菌溶液霧化吸入治療，每天1次，治療5 d。各組在末次激發后24 h內處死小鼠并取材。

2.2 標本收集小鼠于激發后24 h經眼球取血放血后行氣管內插管，仰臥固定，用氣管留置針行氣管插管，縫線固定，以每次4℃0.5 mL PBS灌洗，緩慢注入肺內，輕柔回吸收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，反復注入、回抽3次，回收率＞80%，BALF用EP管回收于冰上備用。打開胸腔，分離支氣管肺組織，右肺迅速置入液氮冷凍后，保存在-80℃冰箱用于real-time PCR檢測。左肺通過氣管插管灌注10%甲醛使肺膨脹進行內固定，取出左肺組織浸入10%甲醛固定，24 h后漂洗、乙醇梯度脫水，經石蠟包埋，沿左肺門斜形平行切取肺組織切片，切片厚4 μm，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)及阿辛藍(Alcian blue，AB)-過碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色。

2.3 支氣管肺泡灌洗液細胞分類計數將BALF 4℃、1 500 r/min離心10 min，棄上清，取沉淀涂片行瑞氏-姬姆薩法染色，計數細胞總數，根據細胞形態特征和染色特點油鏡下計數200個炎癥細胞進行分類計數。

2.4 病理組織學檢查和評分肺組織HE和PAS染色，光鏡下觀察大體組織病變和氣道炎癥細胞浸潤、氣道黏膜充血水腫情況、氣道杯狀細胞及氣道黏液分泌情況。參照文獻［9］的方法確定支氣管周圍炎癥細胞浸潤程度和計數杯狀細胞著色、黏液分泌情況，進行病理半定量分析。評分如下:氣道周圍無炎癥細胞(0分);少許炎癥細胞(1分);較多分布不均的炎癥細胞(2分);大量分布較均勻炎癥細胞，少見聚集成團(3分);大量炎癥細胞聚集成團(4分)。氣道上皮無杯狀細胞(0分);輕度上皮著色，杯狀細胞＜25%(1分);中度上皮著色，杯狀細胞25%～50%(2分);重度上皮著色，杯狀細胞50%～75%(3 分);上皮著色成團，杯狀細胞＞75%(4分)。

2.5 實時熒光定量PCR檢測NF-κB、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達采用Trizol試劑提取肺組織總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測濃度及A260/A280比值。按逆轉錄盒操作說明，將總RNA逆轉錄制備cDNA，-20℃保存。而后取2 μL cDNA作為反應模板，用SYBR Green核酸染料進行熒光定量PCR檢測，β-actin為內參照。β-actin上游引物5＇-AATTCCATCATGAAGTGTGA-3＇，下游引物5＇-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3＇，擴增產物200 bp;NF-κB上游引物5＇-TCCGGGAGCCTCTAGTGAGAA-3＇，下游引物5＇-TCCATTTGTGACCAACTGAACGA-3＇，擴增產物103 bp;ICAM-1上游引物5＇-AACTGTGGCACCGTGCAGTC-3＇，下游引物5＇-AGGGTGAGGTCCTTGCCTACTTG-3＇，擴增產物116 bp;VCAM-1上游引物5＇-GCCACCCTCACCTTAATTGCTATG-3＇，下游引物5＇-TGTGCAGCCACCTGAGATCC-3＇，擴增產物158 bp。PCR反應條件:β-actin(95℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，40個循環);NF-κB(95℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，40個循環);ICAM-1(95℃30 s，95℃5 s，60 ℃31 s，40個循環);VCAM-1(95℃30 s，95℃5 s，62℃31 s，40個循環)。反應結束后，記錄每個樣品管中的熒光強度增加到熒光閾值所對應的擴增循環數(Ct)。以β-actin為內參照，采用相對定量方法對所有樣本進行歸一化處理，計算目的基因mRNA的相對含量(目的基因mRNA/β-actin mRNA)，再進行各組樣品間相對量的比較。

3 統計學處理

數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 16.0軟件分析。用One-way ANOVA比較組間差異，用SNK-q檢驗進行兩兩比較。病理半定量結果采用非參數秩和檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)。采用Pearson或Spearmen相關性檢驗進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 動物的哮喘癥狀表現

模型組小鼠在霧化激發時，出現躁動不安、抓耳撓腮、前肢短縮、打噴嚏、呼吸急促，甚至大小便失禁及腹肌強直等哮喘反應。正常對照組小鼠行為無以上反應，表現正常。

2 BALF中的細胞分類計數

模型組BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞比例增高，與正常對照組比較，差異顯著(均P＜0.01);治療組細胞總數、嗜酸性粒細胞比例較哮喘模型組降低，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)，見表1。

表1 各組支氣管肺泡灌洗液細胞分類計數Table 1.Cell counts in BALF of every group(Mean±SEM.n=8)

3 支氣管肺組織病理觀察

肺組織HE染色以及PAS染色可見，正常對照組氣道上皮黏膜完整，纖毛排列整齊，基底膜及平滑肌層較薄，肺小血管內皮光滑，血管、氣道周圍無炎癥細胞浸潤，肺泡壁結構完整，杯狀細胞少見，無黏液形成，見圖1A1～2。哮喘組氣道上皮細胞腫脹肥大，上皮不完整，黏膜皺襞增多，纖毛排列紊亂，甚至可見支氣管黏膜斷裂;細支氣管及血管周圍、肺泡腔、肺泡隔內大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞和嗜酸性粒細胞為主，肺泡壁增厚，充血水腫，黏膜基底層明顯增厚，平滑肌肥大增生。PAS染色可見氣道上皮杯狀細胞增生肥大，并有大量黏液形成，可見黏液栓，上皮脫落不完整，見圖1B1～2。治療組炎癥浸潤減輕，支氣管管腔通暢，黏膜層完整，上皮細胞排列正常，PAS染色見杯狀細胞及管腔內黏液分泌明顯減少，見圖1C1～2。氣道炎癥細胞浸潤程度及黏液分泌情況病理評分半定量結果經非參數秩和檢驗示:模型組與對照組比較，差異顯著(均P＜0.01)。治療組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)，見表2。

4 肺組織NF-κB、ICAM-1及VCAM-1 mRNA的表達

治療組肺組織NF-κB和ICAM-1 mRNA表達水平較哮喘模型組低，差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)，治療組肺組織VCAM-1 mRNA的表達水平較哮喘模型組低，但無顯著差異(P＞0.05)，見圖2。

Figure 1.Histological study of the lung tissues(HE and ABPAS staining，×400).A1～2:normal group;B1～2:OVA asthma model group;C1～2:inactivated Mycobacterium phlei-treated group.圖1 小鼠肺組織HE染色和PAS染色

表2 氣道炎癥浸潤及黏液分泌病理半定量評分Table 2.Pathological semi-quantitative scores of airway inflammation and mucus production(n=8)

Figure 2.The mRNA expression of ICAM-1，VCAM-1 and NF-κB in the lung tissues detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=8.*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs OVA group.圖2 實時熒光定量PCR測定ICAM-1、VCAM-1和NF-κB mRNA的表達

相關性檢驗:(1)NF-κB分別與炎癥病理半定量分數、黏液分泌半定量分數呈顯著正相關(rs= 0.62，P＜0.01;rs=0.76，P＜0.01)，NF-κB mRNA還與BALF中的嗜酸性粒細胞數百分比呈顯著正相關(r=0.70，P＜0.01);(2)NF-κB、ICAM-1與VCAM-1分別與BALF細胞總數呈正相關(r=0.72，P＜0.01;r=0.55，P＜0.05;r=0.56，P＜0.05); (3)NF-κB分別與ICAM-1、VCAM-1無明顯相關性(均P＞0.05)，ICAM-1與VCAM-1呈顯著正相關(r=0.84，P＜0.01)。

討論

哮喘是由多種炎癥細胞、細胞因子和炎癥介質參與的氣道炎癥性疾病。ICAM-1和VCAM-1均屬于免疫球蛋白超家族黏附分子，對過敏性炎癥的嗜酸性粒細胞積聚有重要的促進作用［10］。草分枝桿菌是一種免疫調節劑，吸入滅活草分枝桿菌在哮喘防治中具有抗炎作用［4］，本實驗中霧化吸入滅活草分枝桿菌有效降低哮喘導致的小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞數升高并減輕其氣道炎癥浸潤程度及黏液分泌。再次證明霧化吸入滅活草分枝桿菌成功減輕哮喘小鼠的氣道炎癥，據此我們猜測其調節黏附分子的表達的能力可能是控制炎癥的一個重要的機制。

眾所周知，白細胞的遷移高度依賴內皮細胞所表達的黏附分子的結構，另外部分白細胞表現出特異的組織靶向也取決于組織表面表達黏附分子的結構［11］。Andersson等［12］發現人臍靜脈血管內皮細胞ICAM-1表達增加具有促進炎癥細胞向肺組織遷移的潛能。另外，ICAM-1在內皮細胞與白細胞相互作用、白細胞向炎癥部位遷移以及抗原呈遞細胞間的相互作用中至關重要，它可作為抗原呈遞細胞刺激T淋巴細胞活化，還可作為細菌性發病機制的輔助因子［13］。Lee等［7］的研究也發現在哮喘小鼠中ICAM-1和VCAM-1水平升高，并調節炎癥細胞遷移。體內外的研究證實肺泡上皮ICAM-1的表達增加可以提高中性粒細胞和巨噬細胞的黏附，并且對過敏性炎癥的嗜酸性粒細胞積聚有重要的促進作用［10，14］，可見細胞黏附分子是肺部炎癥疾病募集白細胞的重要介質。本實驗中哮喘組肺組織的黏附分子水平特別是ICAM-1明顯升高，并且ICAM-1、VCAM-1與BALF中細胞總數呈正相關，黏附分子積極參與支氣管哮喘氣道炎癥發生過程，可能有促進炎癥的作用。而霧化吸入滅活草分枝桿菌治療后肺組織的黏附分子特別是ICAM-1水平顯著降低，因此霧化吸入滅活草分枝桿菌可通過降低黏附分子尤其是ICAM-1的表達來參與控制炎癥，是其控制炎癥的一個重要機制。但是，使支氣管肺組織黏附分子上調的機制又是什么呢?

近年發現，NF-κB在哮喘氣道炎癥中的作用亦十分關鍵。在哮喘的氣道炎癥反應中，IL-1β、TNF-α、IL-8、單核細胞趨化蛋白1、ICAM-1、粒-單細胞集落刺激因子和誘導型一氧化氮合酶等眾多細胞因子和炎癥介質在基因轉錄水平上均受NF-κB調控，NF-κB活化后這些細胞因子和介質的基因表達和蛋白分泌均增高［15］。目前研究證實，在哮喘患者和哮喘的動物模型中，肺組織和氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞的NF-κB活性增高。本實驗哮喘小鼠肺組織中的NF-κB水平較正常小鼠明顯升高，經滅活草分枝桿菌治療后NF-κB水平顯著下降，哮喘炎癥減輕，哮喘小鼠肺組織中NF-κB mRNA與嗜酸性粒細胞數百分比、氣道炎癥浸潤及黏液分泌呈顯著正相關，NF-κB的活化可能促進哮喘小鼠氣道炎癥。滅活草分枝桿菌治療哮喘的機制與降低NF-κB水平有關。NF-κB的水平或許可以作為評判疾病嚴重程度或評估療效的一個替代指標。

NF-κB信號通路參與哮喘中氣道平滑肌細胞增殖［16］。同時，在細胞水平的研究發現通過抑制MAPKs和Akt氧化磷酸化，抑制NF-κB活化，從而抑制TNF-α誘導人支氣管上皮細胞ICAM-1和VCAM-1的產生，減少單核細胞和嗜酸性粒細胞向支氣管上皮細胞黏附，說明氣道炎癥中ICAM-1和VCAM-1的表達水平與NF-κB/MAPK/Akt依賴性信號通路有關［17-18］。之前我們猜測霧化吸入滅活草分枝桿菌可通過NF-κB信號途徑降低黏附分子表達從而減輕哮喘炎癥，而本實驗卻發現NF-κB與ICAM-1、VCAM-1均無明顯相關性。原因可能是除NF-κB外，還存在其它轉錄因子或信號途徑如Sp1、GATA、PKC、STAT1等相關機制的參與影響哮喘中黏附分子的表達，以致滅活草分枝桿菌不能通過NF-κB信號途徑完全抑制哮喘導致的黏附分子的升高，也有可能是各信號途徑相關機制在哮喘不同時期對其影響程度有所差異，此間機制仍待進一步研究。

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Inhalation of inactivated Mycobacterium phlei down-regulates expression of nuclear factor-kappa B and intercellular adhesion molecule-1 in asthmatic mice

Lü Sheng-qiu，LI Chao-qian，MING Mo-yu，LUO Zhi-xi
(Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China.E-mail:2534776680@qq.com)

AIM:To investigate the effect of inhalation of inactivated Mycobacte-rium phlei on the expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB)，intercellular adhesion molecule(ICAM)-1 and vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 in the lung tissues of asthmatic mice.METHODS:Male BALB/c mice(n=24)were randomly divided into normal control group(A)，asthmatic model group(B)，and inactivated Mycobacterium phlei inhalation group(C).Asthmatic model was made by inhalation of chicken ovalbumin.The mice in group C were treated with inactivated Mycobacterium phlei for 5 d.The lung tissues and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were harvested.HE and AB-PAS staining were used to measure the lung inflammation and mucus production.The inflammatory cells in the BALF were counted.The mRNA expression of NF-κB，ICAM-1 and VCAM-1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.RESULTS:Mycobacterium phlei treatment alleviated lung inflammation，attenuated mucus production，and reduced the percentage of eosinophils in the BALF.The mRNA levels of NF-κB and ICAM-1 were significantly decreased after treated with Mycobacterium phlei.However，no significant difference of VCAM-1 mRNA expression was found before and after treatment.The cor-relation between NF-κB mRNA and ICAM-1 mRNA，and between NF-κB mRNA and VCAM-1 mRNA was not found.CONCLUSION:Inhalation of inactivated Mycobacterium phlei attenuates asthmatic airway inflammation.NF-κB participates in the pathogenesis of asthma.NF-κB signal pathway may be associated with the therapeutic mechanism.Another important mechanism is the reduction of adhesion molecule expression.

Asthma;Inactivated Mycobacterium phlei;NF-kappa B;Cell adhesion molecules

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.025

1000-4718(2014)02-0333-06

2013-09-14

2013-11-26

國家自然科學基金資助項目(No.81360007)

△通訊作者Tel:0771-5358397;E-mail:2534776680@qq.com