白細胞介素17在狼瘡性腎炎小鼠中的表達及抗白細胞介素17抗體的干預作用*

徐靚，張慧濤，鄭晶，賈寧，林琳，林宇靜，李玲玲，周文英，張樺△

(中山大學附屬第五醫院1腎內科，2病理科，3中心實驗室，廣東珠海 519000)

白細胞介素17在狼瘡性腎炎小鼠中的表達及抗白細胞介素17抗體的干預作用*

徐靚1，張慧濤1，鄭晶1，賈寧1，林琳1，林宇靜2，李玲玲3，周文英3，張樺1△

(中山大學附屬第五醫院1腎內科，2病理科，3中心實驗室，廣東珠海 519000)

目的:探討白細胞介素17(IL-17)在狼瘡性腎炎(LN)小鼠中的表達及抗IL-17抗體的干預作用。方法：11周齡的雌性MRL/lpr小鼠36只隨機分為實驗組和干預組，另有同齡雌性昆明小鼠18只為對照組。干預組每只小鼠腹腔注射抗小鼠IL-17多克隆抗體20 μg，每2周1次，至實驗觀察點結束。各組分別于第1次給藥后的24 h、14 d及28 d處死6只小鼠。光鏡下觀察腎臟病理情況，ELISA法檢測小鼠血清IL-17的含量，免疫組化法檢測腎組織IL-17的表達水平。結果:MRL/lpr小鼠腎小球系膜細胞及基質彌漫增生，腎小管上皮細胞顆粒及空泡變性，灶狀萎縮，腎間質淋巴及單核細胞浸潤伴纖維化;而干預組腎臟病理改變較實驗組為輕。MRL/lpr小鼠的血清IL-17含量在實驗組各時點均顯著高于對照組(P＜0.05)，而在干預組各時點均顯著低于實驗組(P＜0.05)。IL-17在實驗組小鼠腎小管上皮細胞中的表達明顯增強，在各時點均顯著高于對照組(P＜0.05);在干預組，IL-17在各時點的表達均顯著低于實驗組(P＜0.05)。結論:IL-17在MRL/lpr小鼠血清與腎組織中的表達顯著增加，而抗IL-17抗體可通過抑制IL-17的表達而抑制LN的炎癥免疫反應，減輕腎臟病理損害。

狼瘡性腎炎;白細胞介素17;抗白細胞介素17抗體

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種常見的累及多臟器、多系統的自身免疫性疾病，腎臟是其最常見的受累器官，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE致殘和致死的首位原因［1］。LN發病機制復雜，突出表現為多種自身抗體并通過免疫復合物等途徑誘導的炎癥免疫反應，而炎癥通路的激活、炎癥細胞(特別是巨噬細胞和T細胞)的浸潤及炎癥因子的表達發揮著重要作用［2-4］。研究表明，白細胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和各種趨化因子參與LN的發病及活動狀態，從而引起和促進腎臟損傷。其中近年發現的IL-17是LN發病機制中重要的細胞因子之一，其通過與受體特異性結合發揮促進炎癥反應和免疫應答等多種生物學效應［2-4］。目前尚不清楚拮抗IL-17的產生及其功能能否減輕LN的腎臟損傷。為此，本實驗通過觀察IL-17在不同周齡的MRL/lpr小鼠血清及腎臟中的表達變化，同時使用抗小鼠IL-17抗體進行干預，探討IL-17在LN炎癥免疫反應中的作用以及抗IL-17抗體的干預效果。

材料和方法

1 動物與試劑

健康雌性11周齡SPF級狼瘡小鼠(MRL/lpr)36只和昆明小鼠18只，體重25～26 g，購自廣東省實驗動物中心［許可證號為SCXK(粵)2008-0002］，飼養環境:廣東省實驗動物中心SPF級實驗室。

小鼠IL-17 ELISA試劑盒購自武漢博士德公司;兔抗小鼠IL-17免疫組化多克隆抗體、兩步法免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德公司;抗小鼠IL-17多克隆抗體購自上海今邁生物科技公司。

2 方法

2.1 實驗分組11周齡雌性的MRL/lpr小鼠36只，適應性喂養1周后，隨機分為實驗組和干預組，每組18只。另設相同周齡昆明小鼠18只為對照組。

干預組每只小鼠腹腔注射抗小鼠IL-17多克隆抗體20 μg，實驗組及對照組小鼠腹腔注射等容量生理鹽水，每2周1次，至實驗觀察點結束。

各組分別于第1次給藥(抗IL-17抗體或生理鹽水)后的24 h(12周齡)、14 d(14周齡)及28 d(16周齡)各處死6只小鼠，取血標本和腎臟。以上實驗在廣東省實驗動物中心SPF級實驗室完成。

2.2 形態學觀察及IL-17含量測定制備腎組織石蠟切片，行HE染色光鏡下觀察腎組織的病理學改變。免疫組化法檢測腎組織IL-17的表達水平，實驗步驟如下:石蠟切片常規脫蠟，梯度乙醇入水，檸檬酸鹽抗原修復液高溫高壓修復，過氧化物酶封閉液室溫孵育，滴加適當濃度Ⅰ抗，4℃過夜復溫后滴加Ⅱ抗，DAB溶液顯微鏡下控制顯色，復染細胞核、分化、反藍，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。用PBS代替Ⅰ抗作為空白對照。陽性結果為細胞質染色呈棕黃色，采用全自動圖像分析系統對結果進行半定量分析。結果判定:采用陽性面積百分率評分(0～4分)與陽性強度評分(0～3分)的積分表示。用ELISA法檢測血清IL-17含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

3 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，腎臟免疫組化結果采用半定量分析，組間均數的差異采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，多個樣本均數兩兩之間的比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 腎臟病理改變

對照組小鼠腎臟腎小球、腎小管及腎間質未見異常。在實驗組，MRL/lpr狼瘡小鼠腎小球系膜細胞及基質彌漫增生，伴局灶節段中到重度加重，腎小管上皮細胞顆粒及空泡變性，灶狀萎縮，腎間質淋巴及單核細胞浸潤伴纖維化，腎血管內膜增生，管腔變窄。上述改變從12周齡到16周齡逐漸加重。而在干預組，12周齡時小鼠腎臟病理情況無顯著變化，在14和16周齡時腎小球系膜細胞和基質增生以及腎小管上皮細胞損傷減輕，腎間質淋巴及單核細胞浸潤減少。

2 血清IL-17含量的變化

實驗組小鼠的血清IL-17含量在各時點均顯著高于對照組(P＜0.05)，且隨著時間的延長呈現進行性升高。而在干預組，小鼠血清IL-17含量在各時點均顯著低于實驗組(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)，見表1。

表1 MRL/lpr小鼠血清IL-17含量的變化Table 1.The levels of serum IL-17 in MRL/lpr lupus mice(ng/ L.Mean±SD.n=6)

3 腎組織IL-17的表達

IL-17主要表達于腎小管上皮細胞胞質中，在對照組僅有微量表達，在實驗組則有高表達，且隨小鼠周齡增加表達逐漸增強，在各時點均顯著高于對照組(P＜0.05)。干預組IL-17的表達水平在各時點均較實驗組顯著降低(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)，見圖1、表2。

Figure 1.The expression of IL-17 in the renal tissues of MRL/ lprlupusmice(immunohistochemicalstaining，×400).A:Kunming mice in control group;B: MRL/lpr mice of 12 weeks in experimental group;C: MRL/lpr mice of 14 weeks in experimental group;D: MRL/lpr mice of 16 weeks in experimental group;E: MRL/lpr mice of 12 weeks in intervention group;F: MRL/lpr mice of 14 weeks in intervention group;G: MRL/lpr mice of 16 weeks in intervention group.圖1 MRL/lpr小鼠腎組織IL-17的表達

表2 IL-17在MRL/lpr小鼠腎臟中的表達情況Table 2.The expression of IL-17 in the renal tissues of MRL/lpr lupus mice(Mean±SD.n=6)

討論

MRL/lpr狼瘡小鼠模型是一種研究LN發生機制和評價LN治療方法及效果的理想模型，是目前應用最為廣泛的研究LN的實驗動物模型之一。本實驗選擇12～16周齡的MRL/lpr小鼠作為實驗對象，探討IL-17在LN的早期發生機制和炎癥免疫反應中的作用。結果顯示，IL-17在實驗組MRL/lpr小鼠的血清含量顯著增高，在腎小管上皮細胞中的表達明顯增強，而且隨著小鼠周齡的增加，IL-17呈現進行性升高，同時腎臟病理改變逐漸顯著，且間質內呈現淋巴細胞及單核細胞浸潤。這些結果提示，IL-17參與了LN的發病和病理生理過程。

IL-17可由許多免疫細胞產生，而T淋巴細胞是其主要來源，主要包括CD4+T細胞亞群的Th17細胞和雙陰性T細胞。其生物學功能是具有強大的致炎性，它能促進多種細胞合成并釋放多種生長因子和趨化因子(如IL-8、單核細胞趨化蛋白-1、生長調節因子-α)，并與TNF-α、IL-1等細胞因子有著復雜的相互作用和協同效應;同時IL-17具有強大的募集中性粒細胞的作用，使單核細胞和中性粒細胞迅速增多和大量聚集，并刺激產生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和前列腺素E2，增強局部炎癥和免疫損傷;此外，IL-17可促進B淋巴細胞產生免疫球蛋白，增強B淋巴細胞的功能［4-9］。近年多項研究表明，SLE和LN患者或動物體內有高水平的IL-17表達，腎組織中出現IL-17生成細胞(雙陰性T淋巴細胞)浸潤，且IL-17水平與疾病的活動性及嚴重性相關［6，10-14］;LN患者或動物的腎組織不僅可檢測到產生IL-17的T淋巴細胞，而且模型鼠的臨床表現隨著鼠體內IL-17的產生減少而改善［5，15］。可見IL-17參與LN的炎癥免疫反應過程，并在其中扮演著重要角色。

為進一步探討IL-17在LN的發病和病理生理過程中的作用，本實驗還設立了干預組，使用抗小鼠IL-17抗體對MRL/lpr小鼠進行預處理，結果顯示:干預組小鼠在腹腔注射抗小鼠IL-17抗體后，在各時點IL-17的血清含量均顯著降低，腎組織中的表達亦顯著減少。同時，14周齡后MRL/lpr小鼠的腎臟病理情況得到改善。這些結果提示，使用抗小鼠IL-17抗體能顯著拮抗MRL/lpr小鼠產生的內源性IL-17，從而影響IL-17的生物學效應。抗IL-17抗體可以作為一種阻斷劑，通過抑制或下調IL-17在LN中的表達而達到抑制LN炎癥免疫反應、改善腎臟病變的效果。其他學者的類似研究亦表明，IL-17及其受體可作為LN治療的一個新靶點［3，5，11，13］。

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Expression of interleukin-17 and role of anti-interleukin-17 antibody in MRL/lpr lupus mice

XU Liang1，ZHANG Hui-tao1，ZHENG Jing1，JIA Ning1，LIN Lin1，LIN Yu-jing2，LI Ling-ling3，ZHOU Wen-ying3，ZHANG Hua1
(1Department of Nephrology，2Department of Pathology，3Centre of Laboratory，The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China.E-mail:zh3196@126.com)

AIM:To investigate the expression of interleukin-17(IL-17)and the role of anti-IL-17 antibody in MRL/lpr lupus mice.METHODS:Female MRL/lpr lupus mice(n=36)were randomly divided into experimental group and intervention group，and female Kunming mice(n=18)served as control group.Each mouse in intervention group received intraperitoneal injection of 20 μg anti-mouse IL-17 antibody.The histological examination of the kidney samples was conducted under optical microscope with HE staining.The serum concentration of IL-17 was measured by ELISA.The protein expression of IL-17 in the renal tissues was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTS:Remarkable pathological changes of the renal tissues in experimental group，such as diffuse hyperplasia in glomerular mesangial cells and stroma，granular denaturation of renal tubular epithelial cells，and focal infiltration of lymphocytes and monocytes in renal interstitial，were observed.Significant improvement of renal histology in intervention group was found compared with experimental group.The level of serum IL-17 in experimental group obviously increased as compared to that in control group.The level of serum IL-17 in intervention group was lower significantly than that in experimental group.The protein expression of IL-17 in the renal tissues in experimental group was increased as compared to control group.The expression of IL-17 in intervention group was apparently less than that in experimental group.CONCLUSION:The levels of IL-17 in the serum and renal tissue significantly increase in MRL/lpr lupus mice.Anti-IL-17 antibody may suppress the inflammatoryreaction and renal injury by down-regulating the expression of IL-17 in the mice with lupus nephritis.

Lupus nephritis;Interleukin-17;Anti-interleukin-17 antibody

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.027

1000-4718(2014)02-0343-04

2013-09-15

2013-11-26

廣東省科技計劃(No.2009B03081374);珠海市醫學科研基金(No.20110042)

△通訊作者Tel:0756-2528189;E-mail:zh3196@126.com