鵝毛竹葉提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究

張 蕾，王 姝，倪勤學，許光治，高前欣，張有做*

（1. 浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；

3. 浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；4. 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 臨安 311300）

鵝毛竹葉提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究

張 蕾1,2，王 姝3,4，倪勤學3,4，許光治3,4，高前欣3,4，張有做3,4*

（1. 浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；

3. 浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300；4. 浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 臨安 311300）

采用Folin試劑還原比色法、硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法和香草醛—冰醋酸比色法測定鵝毛竹葉甲醇提取物及不同極性部位中總酚、總黃酮和三萜的含量，采用DPPH法、ABTS法、FRAP法評價各提取物的抗氧化能力及還原能力，同時采用酪氨酸酶催化氧化左旋多巴（L-DOPA）速率法體外測定酪氨酸酶活力。結果表明：鵝毛竹（Shibataea chinensis）葉乙酸乙酯相的總酚、總黃酮及三萜的含量最高，分別為（28.63±0.19）%、（23.74±0.17）%和（15.27 ±0.67）%；該相在不同抗氧化體系中的抗氧化活性最強，同時該相抑制酪氨酸酶的活性也最強，其半抑制濃度為3.29 mg/mL；鵝毛竹葉醇提物及其不同極相部位的總黃酮含量與還原力和DPPH、ABTS自由基的清除能力呈正相關，相關系數分別為0.947 0、0.900 1和0.965 3，表明總黃酮是鵝毛竹葉提取物抗氧化活性的主要成分；總酚含量與酪氨酸酶抑制活性呈正相關，相關系數達到0.991 0，表明總酚是鵝毛竹葉提取物抑制酪氨酸酶活性的主要成分；鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制作用及抗氧化活性最強，其對酪氨酸酶抑制機制為可逆的競爭性抑制，其抑制常數為27.49 mg/mL。

鵝毛竹；竹葉；提取；抗氧化；酪氨酸酶；抑制類型

竹子是非常有利用價值的植物之一，屬于禾本科竹亞科，是多年生的常綠植物。竹葉里含有豐富的次生代謝物，除纖維素、半纖維素、糖類等物質外，還含有許多對人體有益的活性物質，如類黃酮、酚酸類、氨基酸肽類、蒽醌類、萜類內酯等[1～2]。這些成分具有顯著的抗氧化[3]、抗衰老[4]、抗菌[5]、類SOD活性[6]、阻斷亞硝化反應[7]等生理活性。而有關酪氨酸酶活性抑制的報道較少，最早由程科軍等[8]在苦竹筍中分離得一個具有抑制酪氨酸酶活性的氰苷化合物；張永兵等[9]在闊葉箬竹竹葉提取物中分離得具有抑制酪氨酸酶活性的化合物——對羥基肉桂酸乙酯。在我國，竹子品種繁多，分布廣泛，竹葉資源是一種量大而且廉價的林業潛在資源，但是經過化學成分分析的竹種不到20種，僅僅占我國竹種數量的4%左右[10]，而且以往的研究主要集中在剛竹屬的竹種上。倭竹屬鵝毛竹（Shibataea chinensis）由于稈形矮小，被歸為地被竹種，具有開發成葉用竹林的潛在優勢，課題組前期工作比較了6種地被竹種的有效成分含量和抗氧化性能，發現鵝毛竹具有顯著強于其他竹種的抗氧化性能，具有進一步研究的潛力[11]。

本研究對鵝毛竹甲醇提取物及其不同極性部位中的總酚、總黃酮和三萜含量進行了測定，并通過清除DPPH·、ABTS+自由基和還原鐵離子的能力評價了其抗氧化能力，同時對酪氨酸酶活性的抑制作用也進行了初步研究，以期為鵝毛竹資源在食品、化妝品、醫藥和保健領域的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品葉采集：鵝毛竹于2011年9月采自浙江省臨安市浙江農林大學的翠竹園竹種質資源庫。

主要試劑：酪氨酸酶、DPPH（2,2’-二苯基-1-苦味酰苯肼）、ABTS+購自Sigma公司，純度均大于98%；左旋多巴（L-DOPA）購自阿拉丁公司，純度大于99%；甲醇、乙醇、氯化鐵、硫酸、二甲基亞砜、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器與設備

DGG-9053AD型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司），RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），UV-1800紫外分光光度計（島津公司），MultiSkan FC型酶標儀（Thermo Scientific公司），PHSJ-3F型pH計（雷磁公司）等。

1.3 樣品的制備

采集新鮮的鵝毛竹葉子，清洗，瀝干，立刻用微波爐（間隙加熱3次，每次1 min），然后置于烘箱中干燥，粉碎，過40目篩，備用。

稱取5.00 g粉末樣品，加入15倍的甲醇熱回流提取2 h，提取3次，趁熱過濾，洗渣，合并濾液，并用旋轉蒸發儀減壓濃縮至浸膏狀，得到醇提取物。將醇提取物用一定體積的蒸餾水充分混懸，加入一定量的石油醚除去蠟質、色素、油脂等弱極性物質，然后以體積比1：1的溶劑量依次用乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，分別旋轉蒸發除去溶劑后，得到乙酸乙酯相、正丁醇相以及水相，各相溶液濃縮干燥至恒重，備用。

1.4 總酚含量的測定

1.4.1 標準曲線的制作 以對羥基苯甲酸為標準品，采用Folin試劑還原比色法[11]測定，精密稱取對羥基苯甲酸標準品17.2 mg，無水乙醇溶解，容量瓶定容至50 mL，配成0.344 mg/mL的對羥基苯甲酸標準品溶液。準確吸取標準品溶液0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL，移入25 mL具塞試管中，分別用無水乙醇稀釋至10.0 mL。各加入1.0 mL Folin試劑和2.0 mL 20% Na2CO3水溶液，在沸水浴上加熱10 min，用水冷卻并稀釋至25 mL。室溫放置30 min，在745 nm的波長處測定吸光度（A）。以A值為縱坐標（Y），對羥基苯甲酸的質量為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程：

1.4.2 樣品測定 分別精密量取待測液0.1 mL，按繪制標準曲線中的方法在745 nm處測定A值，并根據對羥基苯甲酸的標準曲線，計算各試樣的總酚量。

式中：m1為依據標準曲線計算出被測液中總酚含量（mg），m為供試品取樣量（mg），V1為待測液分取的體積（mL），V2為待測液的總體積（mL）。

1.5 總黃酮含量的測定

1.5.1 標準曲線的制作 以蘆丁為標準品，參照丁明等人[12]的硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法加以改進，準確吸取濃度為150 μg/mL的蘆丁溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入10 mL具塞試管中，用無水乙醇定容至5 mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入

2 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，用無水乙醇定容至10 mL，靜置10 min。在波長510 nm處測定A值。以A值為縱坐標（Y），以蘆丁的質量為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程：

1.5.2 樣品測定 分別精密量取待測液1.0 mL，在510 nm的波長處測定A值，并根據蘆丁的標準曲線，計算各試樣總黃酮含量。

式中：m1為依據標準曲線計算出被測液中黃酮含量（μg），m為供試品取樣量（g），V1為待測液分取的體積（mL），V2為待測液的總體積（mL）。

1.6 三萜含量的測定

1.6.1 標準曲線的制作 用熊果酸作為標準品，采用香草醛—冰醋酸比色法[11]繪制標準曲線。精密稱取熊果酸標準品2.5 mg，用無水乙醇溶解，容量瓶定容至25 mL，即得100 μg/mL熊果酸標準品溶液。精密吸取標準品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，于加熱狀態下氮氣吹干溶劑，分別加入5%香草醛—冰醋酸0.5 mL，高氯酸0.8 mL，混勻后于65 ℃水浴反應15 min，取出放置冰水中冷卻，加冰醋酸5 mL，混勻，在548 nm處測定A值。以在548 nm處測定的A值為縱坐標（Y），以熊果酸的質量為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程：

1.6.2 樣品測定 樣品用無水乙醇適度稀釋，分別精密量取不同待測液0.04 mL，在548 nm處測定A值，并根據熊果酸的標準曲線，計算各試樣的三萜量。

式中：m1為依據標準曲線計算出被測液中熊果酸含量（μg），m為供試品取樣量（g），V1為待測液分取的體積（mL），V2為待測液的總體積（mL）。

1.7 不同極相抗氧化活性測定

1.7.1 DPPH自由基清除試驗 準確稱取DPPH試劑0.01 g，用甲醇溶解至250 mL量瓶中，搖勻得0.10 mmol/L。分別取0.1 mL待測樣液和3.9 mL DPPH溶液混合搖勻，在室溫下反應1 h，517 nm波長下測定A值。以VC作為陽性對照并以甲醇為空白對照，計算各樣品抑制率。

以待測樣品濃度為橫坐標（X），抑制率為縱坐標（Y）得待測樣品清除DPPH自由基的關系曲線。計算得到待測樣品的半數抑制濃度（IC50值）。

1.7.2 ABTS+自由基清除試驗 取176 μL濃度為140 mM的過硫酸鉀水溶液加入到10 mL濃度為0.384 mg/mL的ABTS+溶液中混合，避光反應12 ～ 16 h。

測定之前加入無水乙醇將ABTS+溶液稀釋至吸光值為0.700±0.02（734 nm）下。以無水乙醇為空白試劑將分光光度計調零。將3.9 mL的ABTS+溶液與0.1 mL的待測液溶液混合搖勻，在室溫下反應6 min，在734 nm波長下測定吸光值（A樣品）。3.9 mL的ABTS+溶液與0.1 mL樣品提取劑為空白對照，測的吸光值（A空白）。以VC作為陽性對照。以待測樣品濃度為橫坐標（X），抑制率為縱坐標（Y）得待測樣品清除ABTS+自由基的關系曲線。計算得到待測樣品的半數抑制濃度（IC50值）。

1.7.3 FRAP法分析鐵離子還原能力 參照文獻[13]方法，配制相同濃度0.1 mg/mL的樣品溶液，各取0.3 mL加入2.7 mL工作液（0.3 mo1/L醋酸鹽緩沖液25 mL，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL，20 mmo1/L FeCl3溶液2.5 mL），混勻后在37℃反應10 min，于593 nm處測定A值。以70%乙醇溶液做空白對照。準確量取6.08 mg硫酸亞鐵溶于適量的水中，加入18 mo1/L硫酸0.25 mL，再加水稀釋至50 mL，得0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，并置入小鐵釘。依次配制 400、200、100、50、25 μmol/L標準溶液，以硫酸亞鐵濃度為橫坐標（X），A值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程：

將樣品及對照品VC反應后的A值在標準曲線上獲得相應的硫酸亞鐵的濃度（μmol/L）定義為FRAP值。

1.8 酪氨酸酶活性抑制

1.8.1 酶活力的測定 底物多巴經過酪氨酸酶催化產生多巴醌，多巴醌經氧化生成黑色素，在475 nm波長處黑色素有最大吸收峰，其消光系數為ε=3 700（L·mol－1·cm－1)[14]。酶活力單位（U）定義為：以每分鐘黑色素在475 nm波長的吸光度（OD475）增加0.001為一個酶活力單位。

酶活力測定參考文獻[15]的方法并加以改進：反應總體系為200 μL，5 mM L-DOPA溶液20 μL置于試管中，加入pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液140 μL，于37℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，加入40 μL 250U/mL酪氨酸酶水溶液，并測定一定時間OD475的變化。

1.8.2 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶抑制能力的測定 依照酶活力測定方法，以L-DOPA為底物，加入不同濃度的鵝毛竹葉乙酸乙酯相溶液40 μL使其終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，在37℃恒溫水浴鍋中各自保溫10 min，加入40 μL酪氨酸酶水溶液于37℃恒溫水浴鍋中各自保溫10 min后測定OD475，實驗平行3次，取其平均值，以熊果苷為陽性對照，以磷酸緩沖溶液為空白對照，根據抑制物質量濃度—酶抑制率回歸方程求得半抑制濃度（IC50）。同樣的方法計算醇提物、正丁醇相及水相的半抑制濃度。

1.8.3 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用機理的測定 在上述鵝毛竹葉乙酸乙酯相不同濃度的酶活性測定體系中，底物多巴濃度5 mM固定不變，分別加入250 U/mL酪氨酸酶溶液0、10、20、30、40 μL，測定加入0、4、6、8、10 mg/mL提取物對酶活力的影響，通過作圖法判斷鵝毛竹葉乙酸乙酯相抑制酪氨酸酶活性的抑制機制（實驗做3組平行，取其平均值）。

1.8.4 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用類型和抑制常數的測定 在鵝毛竹葉乙酸乙酯相不同濃度的酶活性測定體系中，固定體系中酶的濃度不變，分別加入5 mM多巴溶液40、50、66.67、100、200 μL，使底物多巴終濃度的倒數為5、4、3、2、1 mM－1，測定加入0、1、2、3、4 mg/mL提取物時，酶活力的變化，抑制類型通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖法判斷。抑制常數Ki和Kis，分別通過雙倒數圖中直線的斜率和縱軸截距對提取物濃度二次作圖求出[16]。

1.9 數據處理

結果采用“SPSS 17.0”統計軟件進行數據分析，結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 鵝毛竹葉不同極相中有效成分的含量

鵝毛竹葉醇提物及不同極相中總酚、總黃酮和三萜含量的測定結果見表1。由表1可知，鵝毛竹葉醇提物的提取率為15.90%，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的提取比例約為 1：2：3。其中醇提物及不同極相中的總酚含量從高到低為乙酸乙酯相 ＞ 正丁醇相 ＞ 醇提物 ＞ 水相，其含量13.74% ～ 28.63%。提取物中總黃酮含量與總酚含量呈正相關，相關系數R2= 0.876 5，總黃酮含量5.27% ～ 23.74%。各提取物中三萜的含量3.75% ～ 15.27%，其含量高低為乙酸乙酯相 ＞ 醇提物 ＞ 正丁醇相 ＞ 水相。

表1 醇提物及不同極相的得率和有效成分的含量（n=3）Table 1 Yield, contents of effective component in the methanol extract and different polarities from S. chinensis %

2.2 鵝毛竹葉不同極相萃取物抗氧化性能的比較

由表2可知，醇提物與不同極性部位對DPPH·和ABTS自由基的清除能力與鐵還原的能力趨勢基本一致。相比陽性對照，醇提物級不同極性部位的抗氧化能力均弱于VC的抗氧化能力，但醇提物與不同極性部位都具有一定的 DPPH自由基和ABTS自由基清除能力，且存在顯著性差異（P＜ 0.05），它們對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力大小順序一樣，依次為VC＞乙酸乙酯相＞正丁醇相＞醇提物＞水相。同時，鵝毛竹葉醇取物及其不同極性部位均表現出不同程度的還原能力，其中乙酸乙酯相的還原力接近與VC的還原力，它們的還原力大小同樣為VC＞乙酸乙酯相＞正丁醇相＞醇提物＞水相。

表2 不同極相的抗氧化活性（n=3）Table 2 Antioxidant activities in different polarities from S. chinensis μg/mL

2.3 不同極相對酪氨酸酶的抑制作用

鵝毛竹葉醇提物及不同極相對酪氨酸酶活性的影響見圖 1。鵝毛竹葉各提取物對酪氨酸酶的抑制作用均低于熊果苷的抑制作用，但均顯示出了一定的酪氨酸酶抑制作用，并對酪氨酸酶活性的抑制作用隨著物質的濃度增加而加強，其中乙酸乙酯相和正丁醇相對酪氨酸酶的抑制作用較為明顯，通過回歸方程計算得出兩者的半抑制濃度（IC50）分別為3.29 mg/mL、5.68 mg/mL，醇提物的半抑制濃度僅次于正丁醇相的半抑制濃度，其IC50為8.30 mg/mL，而水相的半抑制濃度則達到9.46 mg/mL，同樣的方法得到熊果苷的IC50為1.53 mg/mL。

圖1 抑制率與樣品濃度的關系Figure 1 Relationship between inhibitory effect and sample concentration

2.4 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用機制

以酶活力對酶濃度作圖，如果酶活力的變化圖形是一組平行線，則加入的抑制劑對酶抑制作用是不可逆的過程，如果得到一組相交于原點的直線，則加入的抑制劑對酶的抑制作用是可逆的過程[17]。在底物濃度不變，改變酪氨酸酶濃度時，酪氨酸酶經鵝毛竹葉乙酸乙酯相作用后的剩余酶活力與加入的酶量間的關系見圖 2，由圖2可知，隨著反應體系中乙酸乙酯相的濃度增大，直線斜率逐漸下降，所有直線均通過原點，說明鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制作用是可逆過程，也即抑制作用是通過鵝毛竹葉乙酸乙酯相和酶結合有效地抑制了酶活力，從而降低了酶的催化效率，而不是通過減少有效酶量而降低酶活力[18]。

2.5 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用類型和抑制常數

進一步研究鵝毛竹葉乙酸乙酯相抑制酪氨酸酶活性的作用類型，在測定的體系中，酪氨酸酶的濃度固定不變，改變加入底物多巴的濃度，測定濃度為 0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的抑制劑對酶活力的影響，以Lineweaver-Burk雙倒數作圖法判斷抑制劑的抑制類型，其測定結果見圖3。由圖3（a）可知，隨著抑制物濃度的增大，所有的直線均相交于縱軸的一點，Km隨著濃度的增大逐漸增大，Vmax則基本保持不變，所以判斷鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制作用屬于競爭性抑制，表明鵝毛竹葉提取物乙酸乙酯相僅能與游離酶（E）結合，不能與酶—底物復合物（ES）結合。同時，以圖 3（a）中各直線的斜率對抑制劑的濃度進行二次作圖，得到圖3（b），由圖中直線計算出鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制常數Ki= 27.49 mg/mL。

圖2 鵝毛竹葉提取物乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制機制Figure 2 Inhibitory mechanism of the ethylacetate extract from leaves of S. chinensis on tyrosinase

圖3 鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶抑制作用類型和抑制常數Figure 3 Lineweaver-Burk plots for inhibition of ethyl acetate extract from leaves of S. chinensis on tyrosinase

2.6 總酚、總黃酮和三萜含量與抗氧化活性及抑制酪氨酸酶活性的相關性

鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位中有效成分含量與其抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性的相關性見表3。

由表3可知，鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位的總黃酮含量與抗氧化活性存在很大的相關性，它們的抗氧化活性與總黃酮含量的相關系數都在90%以上，因此，可認為黃酮是鵝毛竹葉提取物抗氧化的主要成分。其中總酚含量與ABTS自由基清除能力的相關性略高于總黃酮含量與ABTS自由基清除能力的相關性，而且提取物中總酚含量與酪氨酸酶抑制能力的相關性達到99%以上，這是因為鵝毛竹葉提取物中不僅有黃酮，還存在酚酸類物質，所以酚酸和黃酮是總酚清除ABTS自由基以及抑制酪氨酸酶活性的主要活性成分。同時表3中的數據顯示，酪氨酸酶抑制能力與抗氧化能力之間呈正相關，相關性在90%以上，因此可推斷鵝毛竹葉提取物抑制酪氨酸酶的能力與其抗氧化有很強的關聯性。

表3 鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位總酚、總黃酮和三萜含量與抗氧化活性及酪氨酸酶抑制的相關性Table 3 The correlation between content of total phenols, total flavonoids, triterpenoid and the antioxidant activity, the tyrosinase inhibition in ethanol extract and its different polarities from leaves of S. chinensis

3 討論

天然植物的資源豐富，安全性高，目前從植物資源中提取分離酪氨酸酶抑制劑成為熱點[21]。傅國強等[22]通過對196味中藥對酪氨酸酶活性抑制作用的篩選發現，光果甘草、牡丹皮、蒼耳子、天麻等20味中藥對酪氨酸酶具有顯著抑制作用。Baurin等[23]以桑葉為對照，對隸屬38個屬67種熱帶植物抑制酪氨酸酶活性的作用進行篩選，發現5種熱帶植物也具有抑制酪氨酸酶活性的作用，為研發熱帶植物酪氨酸酶抑制劑提供了一定的科學依據。曾祖平等[24]針對柿葉中對黑素細胞增殖及酪氨酸酶活性有明顯抑制作用的部位進行篩選，研究發現，柿葉醇提取物低濃度時對酪氨酸酶的抑制作用強，萃取后所得各組分對酶的抑制作用低于萃取前的醇提物對酶的抑制作用，三氯甲烷組分與乙酸乙酯組分合并后對酶的抑制作用高于萃取前的醇提物，說明柿葉對酪氨酸酶的抑制可能是由不同成分共同作用的結果。本試驗中，以次生代謝物豐富、生物活性廣泛的竹葉提取物為研究材料，研究其對酪氨酸酶活性的抑制作用及其機理，研究發現在醇提物及不同極性部位中，隨著提取物濃度的增加，抑制能力隨之增強，其中乙酸乙酯相對酪氨酸酶活性的抑制作用最強，其半抑制濃度為3.29 mg/mL，高于萃取前的醇提物對酶的抑制作用。在相關性分析中，總酚含量與酶抑制能力的相關性到達99%以上，可推測，總酚是鵝毛竹葉提取物中抑制酪氨酸酶活性的主要成分。在對乙酸乙酯相對酪氨酸酶抑制類型的研究中表明，乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制表現為可逆的競爭性抑制，其抑制常數Ki = 27.49 mg/mL。

目前，國內外普遍認為酪氨酸酶抑制劑對該酶的抑制機理有4種途徑：一是絡合酪氨酸酶中的銅離子，使銅離子失去對氧的結合能力，降低酶活性；二是作為強抗氧化劑拮抗氧對酪氨酸酶的激活；三是通過清除氧自由基，削弱酪氨酸酶的供氧作用；四是作為酪氨酸酶的競爭性，抑制酶活性[25]。李娜等[26]從清除自由基和螯合金屬離子兩方面研究了紅花黃酮對酪氨酸酶的抑制及其機理，研究發現，紅花黃酮類化合物對DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基均有清除作用，對酪氨酸酶有顯著性。本試驗通過測定鵝毛竹葉提取物清除DPPH自由基、ABTS自由基能力及鐵還原能力研究竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制機理。研究發現，鵝毛竹葉提取物具有清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力和鐵還原能力。相關性分析中，抑制酪氨酸酶活性的能力與抗氧化能力之間呈正相關，相關性在90%以上，因此推斷鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位對酪氨酸酶的抑制作用可能是通過清除自由基，終止自由基鏈的引發，削弱酪氨酸酶反應過程中的供氧而抑制酪氨酸酶催化活性；但是也存在鵝毛竹葉提取物中的抗氧化劑拮抗了氧氣對酪氨酸酶的激活而降低酪氨酸酶的催化活性的可能性，鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的具體抑制作用機制以及具有酪氨酸酶活性的物質還有待進一步分析研究。而且本文僅對酪氨酸酶進行體外實驗，尚有待進一步對鵝毛竹葉提取物細分并進行體內實驗，為鵝毛竹葉的開發利用提供科學依據。同時，為了綜合開發利用我國豐富竹葉資源，也為竹葉活性成分在色素障礙性皮膚病的治療、化妝品行業、食品添加劑等領域的利用提供一定的參考。

[1] 龔金炎，吳曉琴，夏道宗，等. RP-HPLC 法測定竹葉提取物中黃酮類和酚酸類成分[J]. 中草藥，2010， 41（1）：63－65.

[2] 何躍君，岳永德. 竹葉提取物的有效成分及其應用研究進展[J]. 生物質化學工程，2008，42（3）：31－37.

[3] 張英，丁霄霖. 竹葉有效成分和抗活性氧自由基效能的研究[J]. 竹子研究匯刊，1996，13（7）：17－24.

[4] 張英，唐莉莉. 毛金竹葉提取物抗衰老作用的試驗研究[J]. 竹子研究匯刊，1997，14（4）：62－66.

[5] 倪向梅，曹光群. 竹葉提取物的體外抑菌及抗氧化活性的研究[J]. 天然產物研究與開發，2011，2（3）：717－721.

[6] 張英. 竹葉提取物類SOD活性的鄰苯三酚法測定[J]. 食品科學，1997，18（5）：47－49.

[7] 許鋼，張虹，龐潔. 竹葉提取物對亞硝化反應的抑制[J]. 無錫輕工大學學報，2000，19（6）：583－586.

[8] 程科軍，陳競，梁高林，等. Taxiphyllin：苦竹筍中具有酪氨酸酶抑制活性的氰苷[J]. 天然產物研究與開發，2005，17（6）：733－735, 772.

[9] 張永兵. 竹葉提取物對酪氨酸酶和黑色素瘤細胞的影響[D]. 北京：中國林業科學研究院，2009.

[10] 賴炘，陳其兵. 竹葉提取物的化學成分及其生理功能研究進展[J]. 福建林業科技，2013，40（1）：214－220.

[11] 倪勤學，劉穎坤，龔凌霄，等. 6種地被竹葉有效成分及其抗氧化活性研究[J]. 中草藥，2011，42（11）：2 317－2 321.

[12] 丁明，陳少妃，徐耀華. 黃條金剛竹中總黃酮的提取及含量測定[J]. 浙江農業科學，2011（4）：910－913.

[13] Ardestani A, Yazdanparast R. Inhibitory effects of ethylacetate extract of Teucrium polium on in vitro protein glycoxidation[J]. Food Chem Toxicol, 2007, 45（12）：2 402－2 411.

[14] Osvaldo Z, Antonella B, Patrizia C, et al. Truffle-thio-flavours reversibly inhibit truffle tyrosinase[J]. FEMS Microbiol Lett, 2003（220）：81－88.

[15] 樓彩霞，田燕澤，樸香蘭，等. 連翹不同極性部位對酪氨酸酶活性抑制作用研究[J]. 時珍國醫國藥，2011，22（10）：2 415－2 416.

[16] 宋康康，丘陵，黃瑛，等. 熊果甙作為化妝品添加劑對酪氨酸酶抑制作用[J]. 廈門大學學報（自然科學版），2003，42（6）：791－794.

[17] 焉翠蔚，徐睿，孫妍，等. 菲律賓蛤仔提取物抑制酪氨酸酶活性的研究[J]. 中國海洋大學學報（自然科學版），2009，39（6）：1 233－1 236, 1 260.

[18] 孫曉梅. 真江蘺和孔石莼提取物對酪氨酸酶活性抑制作用的研究[D]. 青島：中國海洋大學，2011.

[19] Fenol L G, Penalverm J, Rodriguez-Lopez J N, et al. Tyrosinase kinetics: discrimination between two models to explain the oxidation mechanism of monophenol and diphenol substrates[J]. Int J Biochem & Biol, 2004, 36（2）：235－246.

[20] Kubo I, Chen Q X, Nihei K, et al. Molecular design of antibrowning agents: antioxidative tyrosinase inhibitors[J]. Food Chem, 2003, 81（2）：241－247.

[21] 唐建陽，蘇明星，劉鳳嬌，等. 砂仁提取物對蘑菇酪氨酸酶活力的抑制效應[J]. 廈門大學學報（自然科學版），2012，51（2）：258－262.

[22] 傅國強，馬鵬程，吳勤學，等. 196味中藥乙醇提取物對酪氨酸酶的抑制作用[J]. 中華皮膚科雜志，2003，26（2）：103－106.

[23] Baurin N, Arnoult E, Scior T, et al. Preliminary screening of some tropical plants for anti-tyrosinase activity[J]. J Ethnopharmacol, 2002（82）：155－158.

[24] 曾祖平，張秀梅，李萍，等. 柿葉提取物對黑素細胞增殖和酪氨酸酶活性的影響[J]. 中國民族民間醫藥，2009（20）：1－2.

[25] 張永兵. 竹葉提取物對酪氨酸酶和黑色素瘤細胞的影響[D]. 北京：中國林業科學研究院，2009.

[26] 李娜，魯曉翔. 紅花黃酮對酪氨酸酶的抑制及其機理研究[J]. 食品科技，2010，35（12）：176－179, 190.

Antioxidant and Inhibitory Activities of Extracts from Leaves of Shibataea chinensis on Tyrosinase

ZHANG Lei1,2，WANG Shu3,4，NI Qin-xue3,4，XU Guang-zhi3,4，GAO Qian-xin3,4，ZHANG You-zuo3,4*
（1. Zhejiang University of Science & Technology, Hangzh ou 310 023, China; 2. Zhejiang P rovincial Key Lab for Chem & Bio P rocessing Technology of A gricultural Products, Hangzhou 31 0023, China; 3. College of A griculture and F ood Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 4. Key Lab for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang, Lin’an 311300, China）

The inhibitory effect on tyrosinase and anti-oxidant activity of methanol extract and its different polarities (ethyl acetate, n-butyl alcohol, water) from leaves of Shibataea chinensis was studied. The contents of total phenols, total flavonoids, and triterpenoids in the extracts were detected by Forint reduction assay reagent, aluminum nitrate-sodium nitrite colorimetry, and vanillin-acetic acid assay. The antioxidative and reducing activities of extracts from leaves of S. chinensis were assessed by DPPH, ABTS and FRAP. Tyrosinase activity was estimated by oxidation rate of L-dopa. The result showed that the contents of total phenols, total flavonoids and triterpenoids from leaves of S. chinensis were found the maximum in the ethylacetate, about 28.63%±0.19%, 23.74%±0.17% and 15.27%±0.67%, and had the best inhibitory effect on tyrosinase and antioxidant activity. Its 50% inhibiting concentration was estimated to be 3.29 mg/mL. In addition, positive correlation was existed between the total flavonoids content and the antioxidant ability to reducing power, DPPH· and ABTS for methanol extract and its polarities, with the correlation coefficient of0.947, 0.9001 and 0.9653. It can be concluded that the total flavonoids content is a main component for the antioxidant activity of extracts from leaves of S. chinensis. Meanwhile, positive correlation was existed between their total phenols content and the inhibitory effect on tyrosinase, with the correlation coefficient of 0.991, indicating that total phenols content is a main component for the inhibitory effect on tyrosinase. The ethylacetate extract from S. chinensis is the best and a reversible competitive inhibitor for the oxidation of L-dopa and the anti-oxidant activity is also the best.

Shibataea chinensis; bamboo leaves; antioxidant activity; tyrosinase; inhibition

S718.43

A

1001-3776（2014）05-0008-08

2014-05-17；

2014-07-01

浙江省大學生科技創新活動計劃（2013R412042）；浙江農林大學創新訓練項目（201201006）

張蕾（1981－），女，浙江浦江人，助理研究員，博士生，從事藥用植物功效成分提取與應用；*通訊作者。