Caspase-4活化參與TRAIL誘導的胃癌細胞凋亡

吳 萍，朱雪萍，張旭東，張林杰

（安徽醫科大學免疫學教研室，安徽合肥 230032）

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是腫瘤壞死因子超家族的成員，自1995年被發現以來，由于其特異地殺傷腫瘤細胞而不損害正常細胞的特性受到了腫瘤研究領域的廣泛關注。目前認為TRAIL誘導凋亡主要是通過caspase-8介導的外源性途徑（或死亡受體途徑）和caspase-9介導的內源性途徑（或線粒體途徑）。在caspases家族中還有一類炎性 caspases［1］，在人類主要有 caspase-1、caspase-4和caspase-5，而在小鼠主要有caspase-1、capase-11和caspase-12。人的caspase-4與小鼠的caspase-12在序列上有48%的同源性，兩者都定位在內質網外膜上，二者在內質網應激性凋亡中可能發揮著重要作用［2］。有研究表明，TRAIL也可以引起內質網應激［3-4］，此外，caspase-4參與了 TRAIL誘導的凋亡過程［5-6］。本研究擬探索內質網應激在TRAIL誘導胃癌細胞凋亡中的作用，以及caspase-4在其中的參與情況，以更好地剖析TRAIL誘導胃癌細胞凋亡的過程。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞SGC-7901和BGC-823購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI 1640培養基和Opti-MEM低血清培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；重組人可溶性TRAIL購自Immunex公司；衣霉素（tunicamycin，TM）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自Sigma-Aldrich公司；caspase-4抑制劑（z-LEVD-fmk）購自BioVision公司；小鼠抗人caspase-4單克隆抗體購自Abcam公司；小鼠抗人caspase-3單克隆抗體及兔抗人GRP78多克隆抗體購自Santa Cruz公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；人caspase-4 siRNA序列由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成；Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SGC-7901和BGC-823細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱中培養。

1.2.2 PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡情況 實驗分4組：（1）對照組；（2）TRAIL（200μg·L-1）組；（3）z-LEVD-fmk（30μmol·L-1）組；（4）z-LEVD-fmk（30μmol·L-1）+TRAIL（200μg·L-1）組；每組設3個復孔。將細胞按1×105個／孔接種于24孔板上，次日待細胞處于對數生長期時，給予不同處理24 h。分別收集上清液，每孔加入質量濃度為0.05 g·L-1的 PI溶液750μl，于37℃條件下避光作用10～20 min，待孔內貼壁細胞完全消化后，也收集至相應流式管中，充分混勻，4℃避光過夜，次日上流式細胞儀（Becton Dickinson FACSVerse）檢測細胞的凋亡情況，采用FCSExpress 4軟件分析亞二倍體峰（sub-G1）所占的百分比即為細胞凋亡率。

1.2.3 siRNA轉染胃癌細胞 從GeneBank中檢索人caspase-4基因序列，根據siRNA設計原則，設計3對siRNA（Tab 1），將隨機選取序列的siRNA作為陰性對照（negative control，NC）。轉染前 1 d，接種細胞于6孔板，每孔2×105個細胞，次日細胞融合達30%～50%。實驗分5組：（1）未轉染組（Control）；（2）轉染 NC siRNA組；（3）轉染 caspase-4 siRNA_101組；（4）轉染 caspase-4 siRNA_102組；（5）轉染caspase-4 siRNA_103組，每組設3個復孔。各轉染組均用100μl的Opti-MEM稀釋100 pmol siRNA，柔和混勻，再用100μl的Opti-MEM稀釋7.5μl的Lipofectamine 2000 Reagent，輕輕混勻，室溫放置5 min，將稀釋好的siRNA和Lipofectamine 2000 Reagent混合，室溫放置 20 min，形成 siRNA／Lipofectamine復合物，最后將 200μl siRNA／Lipofectamine復合物滴入到孔中，放入細胞培養箱中，4 h后換液。轉染48 h后提取細胞總蛋白，用Western blot驗證siRNA沉默效果。另外接種細胞于24孔板，按上述方法轉染，轉染24 h后，加入TRAIL（200 μg·L-1）繼續處理24 h，PI染色流式細胞術檢測細胞在轉染siRNA caspase-4后的凋亡情況（方法同“1.2.2”）。

Tab 1 Sequences of caspase-4 siRNA

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達情況 收集細胞，加入100μl的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃14 000×g離心30 min后取上清液，此為細胞總蛋白。采用BCA法蛋白定量后，取20μg行SDS-PAGE電泳分離蛋白，隨后將分離后的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用含質量濃度為50 g· L-1脫脂奶粉的TBST封閉2 h，然后加入一抗，4℃孵育過夜，次日用TBST洗3次，每次10 min，再加入相應的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。電化學發光法顯色，采用天能全自動凝膠圖像分析系統（上海天能科技有限公司）照相并分析結果。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS 11.5軟件對數據進行統計學分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2．1 z-LEVD-fmk能阻止TRAIL誘導的胃癌細胞發生凋亡 PI染色流式細胞術檢測結果顯示，TRAIL單獨作用時，兩株胃癌細胞都快速地發生凋亡，SGC-7901和BGC-823細胞在處理24 h的凋亡率分別為（68.77±4.05）%和（31.17±2.41）%。caspase-4的抑制劑 z-LEVD-fmk對細胞幾乎無毒性，作用24 h的凋亡率和對照組相當，都在5%以下。而當細胞用 z-LEVD-fmk預處理1 h，再加入TRAIL繼續作用24 h時細胞凋亡率分別為（1.67±0.65）%和（14.47±1.62）%，和單用 TRAIL相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），說明z-LEVD-fmk能很大程度上抑制TRAIL誘導的胃癌細胞凋亡（Fig 1）。

Fig 1 Inhibitory effect of caspase-4 inhibitor z-LEVD-fm k on TRAIL-induced apoptosisControl：untreated cells；TRAIL：cells treated with TRAIL（200μg·L-1）for 24 h；z-LEVD-fmk：cells treated with z-LEVD-fmk（30 μmol·L-1）for 24 h；z-LEVD-fmk+TRAIL：cells treated with z-LEVD-fmk（30μmol·L-1）1 h before the addition of TRAIL（200μg·L-1）for a further 24 h.*P＜0.05 vs TRAIL

2．2 siRNA沉默 caspase-4基因能明顯降低caspase-4蛋白的表達水平 利用3條caspase-4 siRNA分別轉染胃癌細胞，Western blot驗證caspase-4的沉默效果，發現和未轉染組（Control）以及陰性對照組（NC）相比，3條 caspase-4的 siRNA序列都能降低細胞中caspase-4的蛋白表達水平，其中在SGC-7901細胞中103序列的沉默效果最好，而在BGC-823中101序列的沉默效果最好（Fig 2）。

Fig 2 Knockdown efficiency of caspase-4 siRNACell lysates were collected 48 h posttransfection and aliquots of 20 μg were subjected to Western blot analysis of caspase-4 levels.

2．3 Caspase-4 siRNA對TRAIL誘導胃癌細胞凋亡的影響 根據上述轉染效果，選擇caspase-4 siRNA_103和101，分別轉染SGC-7901和BGC-823細胞，流式細胞術檢測其對TRAIL誘導凋亡的影響，結果發現轉染caspase-4 siRNA可以部分地抑制胃癌細胞發生凋亡（Fig 3），和陰性對照組（NC）相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

Fig 3 Im pact of caspase-4 siRNA on TRAIL-induced apoptosisCellswere transfected with either the negative control（NC）or the caspase-4 siRNA for 24 h before treatmentwith TRAIL（200μg·L-1）for another24 h and then the apoptotic ratewas detected by FCM.*P＜0.05 vs NC

2．4 TRAIL誘導內質網應激反應 GRP78蛋白表達水平的上調被認為是內質網應激發生的金標準。Fig 4顯示，正常情況下胃癌細胞中GRP78的表達水平很低，TRAIL處理后6 h和16 h有所升高，說明TRAIL能激發內質網應激反應的發生，但其增高的程度遠不及內質網應激經典的誘導劑衣霉素（TM）的作用。

Fig 4 Upregulation of GRP78 by TRAILCells were treated with 200μg·L-1 TRAIL as indicated before measurement of the expression ofGRP78 byWestern blot.The classic ER stress inducer TM（3μmol·L-1）was used as a control.

2．5 TRAIL作用早期caspase-4發生活化 Western blot檢測在TRAIL處理后不同時間caspase-4和caspase-3的活化情況，結果顯示 Pro-caspase-4在TRAIL作用后120 min開始下降，到180 min時降低明顯，而Cleaved-caspase-4最早出現在TRAIL作用后的 30 min。Caspase-3活化得更早，Cleavedcaspase-3出現在TRAIL作用10 min以后（Fig 5）。

Fig 5 Activation of caspase-3 and caspase-4 after TRAIL treatmentCells were treated with TRAIL at 200μg· L-1 for the indicated time periods beforemeasurement of the expression level of caspase-3 and caspase-4 by Western blot.

3 討論

既往我們對TRAIL誘導胃癌細胞凋亡的過程進行了深入的研究，發現除了死亡受體途徑外，線粒體途徑也參與其中［7］。但越來越多的證據表明，TRAIL誘導的凋亡可能還有其他細胞器的參與，如內質網［8］和溶酶體［9］。目前對內質網應激性凋亡途徑還不十分清楚，一般認為主要是通過活化caspase-12、產生活性氧、激活JNK以及轉錄因子CHOP所介導［10］。其中caspase-12顯得尤為重要，因為早期研究發現caspase-12缺陷的小鼠細胞對內質網應激性的凋亡完全抵抗［11］，然而caspase-12只在嚙齒類動物中表達，人類缺乏有功能的caspase-12［2］。近幾年的研究認為，人的caspase-4能替代小鼠caspase-12的功能，二者在序列上相似，且都定位在內質網外膜上。Jiang等［12］發現，如果把GRP78的抑制作用去掉，caspase-4能明顯地使黑色素瘤細胞發生內質網應激性的凋亡。此外caspase-4還參與了TRAIL誘導的人類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞和黑色素瘤細胞的凋亡［5-6］。

本研究采用caspase-4特異的抑制劑z-LEVD-fmk在TRAIL作用之前1 h對細胞進行預處理，發現z-LEVD-fmk能明顯降低TRAIL誘導的胃癌細胞凋亡，這種作用在SGC-7901細胞中尤為明顯。此外利用 caspase-4 siRNA轉染胃癌細胞，也使得TRAIL誘導的細胞凋亡受到部分抑制。以上兩個結果充分說明caspase-4參與了TRAIL的凋亡信號轉導。Western blot檢測到GRP78蛋白表達水平上調，但是這種升高的程度有限，遠低于經典的內質網應激誘導劑TM的作用，說明TRAIL激活了較低水平的內質網應激反應。另外TRAIL作用30 min起Cleaved-caspase-4即出現，而Cleaved-caspase-3出現得更早，說明caspase-4比caspase-3活化得晚。有報道稱TM引起的caspase-4活化不依賴于caspase-8的活化，且在 caspase-9和 caspase-3活化的上游［12］，而 TRAIL誘導的 caspase-4活化發生在caspase-3的下游［6］，可見在TM和TRAIL誘導的不同程度的內質網應激性凋亡途徑中，信號轉導通路有很大的不同，但其中具體的分子機制仍不清楚。

綜上所述，本研究顯示caspase-4活化對TRAIL誘導胃癌細胞的凋亡是必需的，此外TRAIL激活caspase-4與中等程度的內質網應激反應有關。內質網應激性凋亡途徑的參與將幫助我們更全面地了解TRAIL誘導胃癌細胞凋亡的調控機制，找到增加細胞對TRAIL敏感性的新靶點。

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