星天牛成蟲對楝揮發(fā)性物質(zhì)的GC-EAD反應(yīng)

劉佳敏，徐華潮

（浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300）

星天牛成蟲對楝揮發(fā)性物質(zhì)的GC-EAD反應(yīng)

劉佳敏，徐華潮*

（浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300）

采用活體植物動(dòng)態(tài)頂空套袋法與氣質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)，對楝（Melia azedarach）的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，并且利用GC-EAD技術(shù)測定了星天牛（Anoplophora chinensis）成蟲對楝揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的GC-EAD反應(yīng)，結(jié)果表明：楝的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)有20種，其中含有萜烯類化合物（97.71%）8種，烴類化合物（1.021%）5種，醇類化合物（0.23%）3種，酮類化合物（0.02%）1種；星天牛成蟲的觸角對5種化合物的刺激作用比較敏感，其中對β-蒎烯刺激活性最高，對左旋-α-蒎烯、月桂烯、丁苯、桃金娘烯醇有較輕微的反應(yīng)。

星天牛；動(dòng)態(tài)頂空；揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)；GC-MS；GC-EAD

星天牛（Anoplophora chinensis）屬鞘翅目（Coleptera）天牛科（Cerambycidae），是在我國分布較廣，危害樹木種類較多的一種蛀干性害蟲。既蛀食大樹，也取食幼樹，切斷輸送養(yǎng)分和水分的通道，導(dǎo)致樹木衰弱或死亡[1]。天牛對樹木的危害選擇性很強(qiáng)，不同樹種對天牛危害或忌避或抗或被喜食[2～3]。

能夠引起天牛遠(yuǎn)距離行為反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)主要是植物的揮發(fā)性有機(jī)物。植物揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds, VOCs）是植物通過次生代謝途徑合成的低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的小分子化合物，參與植食性昆蟲行為的調(diào)控[4～6]。有研究表明，植物釋放的特定的揮發(fā)性氣味物質(zhì)能夠?qū)μ炫Ｆ鸬揭T的作用[7～9]。

在對星天牛行為和習(xí)性的觀察研究中，發(fā)現(xiàn)其成蟲特別喜歡取食楝樹（Melia azedarach）皮作為補(bǔ)充營養(yǎng)，而且成蟲壽命一般可達(dá)40 ～ 50 d[10～11]。本文采用動(dòng)態(tài)頂空套袋采集法收集楝的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）分析技術(shù)對楝的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，并利用電生理學(xué)技術(shù)，研究星天牛成蟲對楝植株釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的GC-EAD反應(yīng)，為篩選出對星天牛具有生物活性的植物源引誘劑奠定理論基礎(chǔ), 從而為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對星天牛危害的生態(tài)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

在慈溪市沿海防護(hù)林柳樹木段中采集星天牛成蟲300余頭，放置于自然條件下人工飼養(yǎng)，成蟲羽化后收集備用。

1.2 材料與儀器

2年生楝選自慈溪市沿海防護(hù)林。大氣采樣儀（QC-1型）；氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5975C GC/MSD）；

1.3 楝揮發(fā)性氣體化學(xué)成分的收集與測定

1.3.1 試驗(yàn)方法 采用動(dòng)態(tài)頂空套袋采集法收集2年生楝植株自然狀態(tài)下所揮發(fā)的氣體。將聚乙烯塑料袋緊緊的綁在楝樹干上，連接好抽氣泵及填有0.5 cm super-Q吸附劑的玻璃管（7 cm×0.5 cm ID)，用玻璃棉將兩端密封，出氣口與5 cm活性炭的玻璃管（7 cm×1 cm ID）相連。氣流計(jì)維持1.5 L/min的平穩(wěn)氣流，采樣設(shè)備的所有部件通過硅膠管相連。采樣時(shí)間為5 h（10:00－15:00），每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。每個(gè)揮發(fā)物樣品用含有以正十二烷（150 ppb）為內(nèi)標(biāo)的色譜純正己烷（500 μL）洗脫，洗脫后的樣品保存在－5℃待用。

1.3.2 儀器條件 儀器是氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5975C GC/MSD）。載氣是99.999%氦氣，氣流為1.5 mL/min。色譜柱為DB-5MS，60 m×0.25 mm（I.D.）×0.25 μm（film）。每次進(jìn)樣1 μL，分流比為100：1。升溫程序?yàn)椋?0℃恒溫2 min，然后以10℃/min的速度升溫到250℃，最后250℃恒溫5 min。溶劑延遲2 min。離子源溫度230℃，四極桿150℃。Aux-2進(jìn)樣口溫度為280℃，前進(jìn)樣口溫度為250℃，質(zhì)譜轟擊電壓為70eV，掃描的質(zhì)量范圍為20 ～ 300，共運(yùn)行27 min。

1.4 GC-EA D測定

1.4.1 測定方法 GC-EAD實(shí)驗(yàn)在中國科學(xué)院動(dòng)物研究所進(jìn)行。將星天牛成蟲的觸角沿基部剪下，尖端切除少許后，用導(dǎo)電膠將其橫搭在電極上。每種標(biāo)樣各取3 μL進(jìn)樣到氣相色譜中進(jìn)行GC-EAD分析。試驗(yàn)用蟲均為活體，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，GC-EAD色譜圖上的化合物的峰形和保留時(shí)間進(jìn)行詳細(xì)對比，從而鑒定具有活性的物質(zhì)。1.4.2 儀器條件 色譜條件：Agilent 6890N-5973N氣相色譜，色譜柱為DB-5MS，60m (long)×0.25mm (I.D.) ×0.25mm (film)；載氣：氦氣，氣流為1 mL/min；無分流進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫條件：柱箱起始溫度50℃，保留1min，然后以5℃/min 的升溫速率升到250℃；氫火焰檢測器；觸角電位檢測器。

2 結(jié)果分析

2.1 楝揮發(fā)性氣體化學(xué)成分分析

分離所得的揮發(fā)性物質(zhì)化合物，通過檢索Xcalibur軟件（Finnigan）所帶的NIST庫中的圖譜，結(jié)合保留時(shí)間，進(jìn)行比較鑒定。分析鑒定結(jié)果，從圖1楝揮發(fā)性氣體GC/MS總離子流圖可檢出25個(gè)化合物，實(shí)際鑒定出20種，其他化合物由于質(zhì)譜信息量不足無法確定，其中已確定化合物占總檢出量80%。采用色譜面積歸一法分析得到表1，由表1可知揮發(fā)性物質(zhì)組分中左旋-α-蒎烯相對含量較高，楝揮發(fā)性氣體中（依據(jù)相對含量）已知含有萜烯類化合物（97.71%）8種，烴類化合物（1.021%）5種，醇類化合物（0.23%）3種，酮類化合物（0.02%）1種。主要成分是萜烯類化合物、烴類化合物，含有最多的萜烯類物質(zhì)是左旋-α-蒎烯，占有89.07%。楝自然狀態(tài)下?lián)]發(fā)性氣體的最主要成分是萜烯類化合物，符合揮發(fā)物成分的共性。

圖1 楝揮發(fā)性氣體GC/MS總離子流圖

表1 楝揮發(fā)性氣體成分

2.2 星天牛對楝揮發(fā)性氣體的GC-EAD應(yīng)用

根據(jù)5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的圖譜，選擇出其中一個(gè)刺激較為明顯并且具有重復(fù)反應(yīng)的圖譜，星天牛成蟲對20種揮發(fā)性物質(zhì)的GC-EAD分析結(jié)果，如圖2所示。

圖2 星天牛對楝樹枝揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的GC-EAD反應(yīng)圖譜

由圖2可知星天牛成蟲的觸角對5種化合物的刺激作用比較敏感，其中β-蒎烯刺激活性最高，左旋-α-蒎烯、月桂烯、丁苯、桃金娘烯醇能對光肩星天牛成蟲的觸角喚起輕度的反應(yīng)，其余化合物對觸角沒有明顯的刺激反應(yīng)。

3 結(jié)論

利用動(dòng)態(tài)頂空套袋法對楝自然狀態(tài)下?lián)]發(fā)的氣體進(jìn)行收集，并通過氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行進(jìn)一步的分析與鑒定，能比較真實(shí)的反映出自然狀態(tài)下楝所釋放出的氣體情況。本次實(shí)驗(yàn)表明，星天牛嗜食樹種楝的揮發(fā)性物質(zhì)主要由20種化合物組成，自然狀態(tài)下的揮發(fā)性氣體強(qiáng)度以萜烯類最多，達(dá)到89.07%，醇類和酮類化合物相對較弱。萜類化合物分布廣泛，種類繁多，是植物次生代謝物中最多的一類化合物[12～14]。

昆蟲的化學(xué)信息物質(zhì)具有明顯的物種特異性，并且在昆蟲的生境選擇、交配定位和種群分布過程中起著重要作用。研究化學(xué)信息物質(zhì)對昆蟲觸角的GC-EAD反應(yīng)有利于篩選生物活性化合物，為害蟲的綜合治理提供有效的生態(tài)防治方法。

以往在研究植物揮發(fā)物和昆蟲之間的關(guān)系時(shí)，首先根據(jù)文獻(xiàn)通過篩選初步確定目標(biāo)組分；然后利用試劑純品逐一進(jìn)行生物測定以確定其對昆蟲的行為反應(yīng)（EAG測定技術(shù)），過程重復(fù)，操作繁瑣，相比之下，利用GC-EAD技術(shù)可以直接用揮發(fā)物的提取物檢測得到活性組分。本次實(shí)驗(yàn)GC-EAD的測定結(jié)果表明楝的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)中有5種化合物對星天牛成蟲觸角的刺激作用比較明顯，其中β-蒎烯刺激活性最高，其次為左旋-α-蒎烯、月桂烯、丁苯、桃金娘烯醇，其數(shù)據(jù)與以前相比，更為可靠、有效，同時(shí)很大程度上可以提高工作效率。這 5種化合物對星天牛野外的實(shí)際誘集能力如何，最終要通過具體的野外生物測定進(jìn)一步確定，而后研制出對星天牛具有一定引誘作用的引誘劑配方，為星天牛的防治提供新的技術(shù)手段。

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GC-EAD Response of Anoplophora chinensis to Volatiles from Melia azedarach

LIU Jia-min，XU Hua-chao*
（Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Voltile organic compounds/VOCs from Melia azedarach were collected by dynamic headspace and determined by TDS/ GC/MS. Response of Anoplophora chinensis to VOCs was detected by GC-EAD. The result demonstrated that there were 20 types of VOCs from M. azedarach, including 8 terpenoids(97.71%), 5 aromatics(1.021%), 3 alcohols(0.23%), 1 ketones(0.02%). GC-EAD detection showed that that the antenna of A. chinensis were sensitive to five compounds. Beta-pinene had the most effective to the insect, and L-alpha-pinene, myrcene, styrene butadiene and myrtenol had litter effect.

Anoplophora chinensis; head space collection; GC-MS；GC-EAD

S763.38

A

1001-3776（2014）02-0028-04

2013-09-12；

2014-02-12

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2010C12029）

劉佳敏（1987－），女，山西人，碩士生；*通訊作者。