大黃酚對鉛中毒小鼠免疫功能的影響

張 季，嚴春臨，侯 勇，王 樹，張丹參，薛貴平，董曉華

（1.河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000，2.河北科技大學，河北 石家莊 050018）

鉛（lead，Pb）是一種常見的工業毒物和環境污染物，鉛中毒不僅可引起體內應激反應，導致脂質過氧化損傷，造成學習記憶障礙，而且鉛對動物的免疫系統有嚴重的損傷，削弱機體的抵抗力，增加機體對細菌、病毒感染的易感性和腫瘤的發生率［1－2］。研究表明，在體內鉛能夠降低巨噬細胞的吞噬功能，使臟器指數下降，抑制 B淋巴細胞的轉化、增生［3］。鉛可使白細胞數減少、白細胞的吞噬能力下降，引起外周B淋巴細胞減少，抑制細胞因子白細胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-10以及干擾素 γ（IFN-γ）等細胞因子的產生［4－6］。大黃酚（chrysophanol，Chry）是從中藥大黃（rhubarb）中提取的蒽醌類化合物之一，具有改善學習記憶障礙、抗衰老等作用［7－9］。大黃酚能夠改善鉛中毒小鼠的學習記憶能力，清除鉛中毒小鼠體內自由基，減少過氧化脂質的生成，降低鉛中毒小鼠腦、肝、腎、脾等組織內的鉛水平［10－11］。本課題主要研究大黃酚對鉛中毒小鼠的臟器指數、白細胞數、脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活性、吞噬細胞吞噬功能及血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等指標的影響，全面考察大黃酚對鉛中毒小鼠的免疫功能的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康、昆明種♂小鼠（SPF級），體質量（20±2）g，由中國醫學科學院實驗動物中心提供。全部動物在實驗室適應性飼養3 d后用于實驗，分籠飼養，自由飲食和飲水，室溫（20±2）℃。

1.2 藥品與試劑 大黃酚購自中國藥品生物制品檢定所，實驗前用N，N二甲基甲酰胺溶解，吐溫－80助溶，再加入生理鹽水混勻，N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫－80∶生理鹽水＝1∶1∶8；實驗前用生理鹽水稀釋至所需濃度［7］；醋酸鉛購自天津化學試劑六廠；刀豆蛋白（coneanvalinA，ConA），脂多糖（lipopolysaceharides，LPS）、四甲基偶氮唑藍（5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）均為 Sigma公司產品，RPMI 1640購自北京海克隆生物化學制品有限公司；IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，二甲基亞砜（DMSO）、中性紅購自天津市化學試劑一廠。

1.3 儀器 Safire2多功能酶標儀：奧地利；ME235P型電子分析天平：北京賽多利斯儀器有限責任公司；Sigma-3K30高速冷凍離心：德國；JB-HS-1300超凈工作臺：蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；BC-J160S二氧化碳培養箱：上海博訊實業有限公司。

1.4 分組與給藥 50只小鼠隨機為5組，每組10只，分別為溶媒組（control group）；鉛中毒組（模型組，model group）；大黃酚治療組（高、中、低劑量分別為 10.0、1.0、0.1 mg·kg－1）。模型制備：模型組和大黃酚治療組（Chry groups）每天腹腔注射（peritoneal injection，ip）7 mg·kg－1醋酸鉛溶液（10 ml·kg－1），連續腹腔注射8 d醋酸鉛溶液造成鉛中毒模型；溶媒組每天腹腔注射等量的生理鹽水，造成鉛中毒模型。造成鉛中毒模型后d 4開始給藥：大黃酚治療組腹腔注射相應劑量的大黃酚（10 ml·kg－1）；溶媒組與模型組腹腔注射10 ml·kg－1溶劑（N，N-二甲基甲酰胺 ∶吐溫80∶生理鹽水＝1∶1∶8），每天 1次，連續給藥 14 d［10］。

1.5 取材與處理 d 14給藥1 h后，精密稱定小鼠體重，并記錄，眼球摘除取血法收集血液，分離血清凍存備用，然后快速斷頸處死小鼠，將其浸入體積分數為0.75的乙醇中2 min，用15 ml含肝素的冷PBS液灌洗腹腔，無菌條件吸取腹腔液5 ml用于腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定；于超凈工作臺取出胸腺、脾臟，并剝離周圍組織，用濾紙吸取周圍液體，分別精密稱定小鼠胸腺和脾臟的濕重，并將脾臟制成脾細胞懸液用于小鼠脾淋巴細胞增殖能力和NK細胞活性測定［12］。

1.6 免疫指標的測定

1.6.1 小鼠臟器指數及白細胞數的測定 利用小鼠胸腺和脾臟的濕重以及小鼠體重計算小鼠臟器指數，胸腺指數（TI）＝胸腺重量（mg）／小鼠體重（g），脾臟指數（SI）＝脾重量（mg）／小鼠體重（g）；用毛細管取20μl全血加入盛有0.38 ml白細胞稀釋液的試管中，混勻，溶血后輕輕震蕩2 min于顯微鏡下計數。

1.6.2 小鼠脾淋巴細胞增殖能力測定 用5 ml PBS液清洗脾臟去除血液，用濾紙吸去PBS，將脾臟轉移至200目篩網上，輕輕的用注射器芯頭將其研碎，并用PBS輕輕沖洗鋼網，制成脾細胞溶液，用于淋巴細胞增殖能力。取適量脾細胞溶液于1 000 r·min－1離心5 min，棄去上清液，添加紅細胞裂解液1 ml，30℃水浴 5 min后 2 000 r·min－1離心 5 min，用RPMI 1640培養液將細胞稀釋成2×109·L－1的細胞懸液。參考文獻［13］方法采用酶標儀在570 nm波長處測量各孔的吸光度值（A值）。并計算B淋巴細胞的增值能力及T淋巴細胞的增值能力。

1.6.3 小鼠NK細胞活性測定 以制備好的淋巴細胞懸液為效應細胞，以K562細胞為靶細胞，靶細胞為復蘇傳代后收集的對數期K562細胞（細胞濃度為 4×108·L－1）。參照文獻［12－13］方法在 96孔培養板中設試驗孔、靶細胞對照孔、效應細胞對照孔，采用酶標儀570 nm波長處測量各孔的吸光度值（A值），計算NK細胞活性。NK細胞活性／%＝靶細胞對照孔A－試驗孔A－效應細胞對照孔A）／靶細胞對照孔A×100%。

1.6.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能測定 采用中性紅比色法測定腹腔巨噬細胞吞噬功能，酶標儀于540 nm測定其吸光度A540nm，并以A540nm為評價指標［6］。

1.6.5 小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4和 IL-10含量測定 參考文獻［13］方法，按照試劑盒說明以酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4和 IL-10含量。

1.7 統計學分析 數據以表示，采用SPSS 14.0版本統計學軟件處理，組間比較采用F檢驗。

2 結果

2.1 大黃酚對鉛中毒小鼠體重的影響 結果見Tab 1，結果表明各組小鼠體重在鉛中毒前并無明顯差異，染鉛14 d后，模型組小鼠體重明顯低于溶媒組，大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）小鼠體重明顯高于模型組小鼠體重。比較各組小鼠染鉛前后體重變化發現模型組與其他各組差異均有顯著性。

Tab 1 Influence of Chry on the weight of the lead poisoning m ice（ˉx±s，n＝10）

2.2 大黃酚對鉛中毒小鼠臟器指數和白細胞計數的影響 與溶媒組小鼠比較鉛中毒模型組小鼠脾臟指數、胸腺指數和白細胞計數均明顯降低，大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）能明顯提高鉛中毒小鼠臟器指數和白細胞計數（P＜0.01）。大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）能明顯提高鉛中毒小鼠脾臟指數（P＜0.05），但對鉛中毒小鼠胸腺指數及白細胞計數并無明顯改善作用，結果見Tab 2。

2.3 大黃酚對鉛中毒小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響 與溶媒組小鼠相比，鉛中毒模型組B脾淋巴細胞增殖能力和T脾淋巴細胞增殖能力均明顯降低（P＜0.01），大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒小鼠B脾淋巴細胞增殖能力和T脾淋巴細胞增殖能力（P＜0.01），大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒小鼠B脾淋巴細胞增殖能力（P＜0.01）和T脾淋巴細胞增殖能力（P＜0.05），結果見 Tab 2。

2．4 大黃酚對鉛中毒小鼠巨噬細胞吞噬能力和NK細胞活性的影響 與溶媒組小鼠相比，鉛中毒模型組小鼠巨噬細胞吞噬能力和NK細胞殺傷力均明顯降低（P＜0.01），大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒巨噬細胞吞噬能力和NK細胞殺傷力（P＜0.01），大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒小鼠巨噬細胞吞噬能力（P＜0.01）和 NK細胞殺傷力（P＜0.05），結果見Tab 2。

2．5 大黃酚對鉛中毒小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10含量的影響 與溶媒組相比鉛中毒模型組小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量均明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4含量未見明顯變化（P＞0.05），僅IL-10含量明顯升高（P＜0.05），結果見 Tab 3。

3 討論

白細胞數目、臟器指數、NK細胞活性、吞噬細胞吞噬能力以及B、T脾淋巴細胞增殖能力都是反映機體免疫功能的重要指標［14］。連續8 d腹腔注射7 mg·kg－1醋酸鉛溶液能夠明顯降低小鼠的免疫功能，主要表現為白細胞數目減少，臟器指數降低，出現明顯的胸腺和脾臟萎縮。研究發現鉛中毒小鼠B、T脾淋巴細胞增殖能力、NK細胞活性與吞噬細胞吞噬能力均明顯降低。鉛對T淋巴細胞增生和分化的影響，研究結果不盡相同，有研究表明鉛抑制了T淋巴細胞的增生和分化［15］；另有研究認為鉛促進了T淋巴細胞的增生和分化［16］，本課題研究發現鉛抑制了小鼠T淋巴細胞的增殖能力，筆者認為鉛對淋巴T細胞的增殖與分化的影響與鉛在動物體內的濃度有密切的關系，對鉛濃度與淋巴細胞增殖能力的相關性研究十分必要。

Tab 2 Influence of Chry on the immune function of the lead poisoning m ice

Tab 2 Influence of Chry on the immune function of the lead poisoning m ice

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／mg·kg－1 NK cell activity／%Control － 3.98±0.48 2.99±0.27 12.61±1.23 0.9 Spleen index／mg·g－1 Thymus index／mg·g－1 Count ofWBC／109·L－1 The phagocytosis ofmacrophage 2±0.07 43.77±9.12 Model － 2.89±0.51** 2.17±0.33** 10.44±1.17** 0.47±0.03** 25.26±6.45**Chry 0.1 3.34±0.43＃ 2.45±0.29 11.47±1.42 0.53±0.05＃＃ 29.51±6.79 Chry 1.0 3.65±0.47＃＃ 2.68±0.31＃ 11.78±1.37＃＃ 0.68±0.04＃＃ 35.45±7.14＃＃Chry 10.0 3.79±0.55＃＃ 2.82±0.27＃＃ 12.11±1.23＃＃ 0.77±0.05＃＃ 36.11±7.22＃＃

Tab 3 Effect of Chry on the concentration of IFN-γ，IL-2，IL-4 and IL-10 in the lead poisoningm ice serum

Tab 3 Effect of Chry on the concentration of IFN-γ，IL-2，IL-4 and IL-10 in the lead poisoningm ice serum

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／mg·kg－1 IFN-γ／ng·L－1 IL-2／ng·L－1 IL-4／ng·L－1 IL-10／ng·L－1 Control － 100.37±8.14 108.25±5.17 56.13±3.965.37±5.71 Model － 78.25±7.56** 91.33±6.02** 40.18±4.58** 43.52±5.26**Chry 0.1 83.68±6.35 96.51±6.25 44.12±4.51 49.13±4.98＃Chry 1.0 92.44±7.61＃＃ 99.36±6.17＃＃ 48.51±4.81＃＃ 56.12±5.64＃＃Chry 10.0 94.51±7.88＃＃ 103.11±6.38＃＃ 51.36±4.86＃＃ 60.38±5.58 6＃＃

細胞因子是具有調節機體免疫功能的重要蛋白質。根據自身所分泌的細胞因子，CD4＋亞群（Th細胞）分為Th1和Th2兩個亞群，二者在體內保持平衡［17］。Th1和Th2細胞是兩種重要的淋巴細胞亞群，Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等細胞因子，Th1細胞主要介導細胞免疫反應，Th2細胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13。Th2細胞主要調節體液免疫反應［18］。通過檢測鉛中毒小鼠血清中IFN-γ、IL-2和 IL-4、IL-10分別反映Th1和 Th2細胞亞群的功能變化，研究發現鉛中毒小鼠血清中IFN-γ、IL-2和 IL-4、IL-10細胞因子均受到明顯的抑制，不同劑量的大黃酚可不同程度的提高血清中IFN-γ、IL-2和 IL-4、IL-10細胞因子的含量，提示大黃酚通過提高鉛中毒小鼠體內各種細胞因子的含量改善鉛對小鼠造成的免疫損傷，大黃酚對Th1和Th2兩個細胞亞群的調節是一致的，并未打破二者的平衡。

從給藥劑量來看，大黃酚中、高劑量組能夠全面的改善鉛中毒造成的免疫功能抑制，與模型組相比大黃酚低劑量組對大部分免疫指標并無影響，而且在前期研究中也發現低劑量大黃酚對鉛中毒小鼠的學習記憶能力以及血鉛和組織內鉛含量也并無明顯改善作用［10－11］，因此，在今后的研究中可以省去0.1 mg·kg－1劑量組，探索其他劑量來尋找大黃酚治療鉛中毒的最小劑量。

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