HPLC 法同時(shí)測(cè)定大鼠肝微粒中原兒茶酸和香草酸的含量

代 晶，石明芯，王佳慧

兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)是生物體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶，能夠通過S-腺苷-L-甲硫氨酸使藥物發(fā)生甲基化反應(yīng)，對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)產(chǎn)生影響。除此以外，其活性高低還與帕金森、精神分裂癥、抑郁癥、乳腺癌、白癜風(fēng)等疾病存在相關(guān)性［1-3］。因此，測(cè)定COMT活性對(duì)于研究藥物與COMT的關(guān)系，診斷和治療某些疾病具有重要意義。COMT在肝中活性最高，而肝微粒體中含有豐富的Ⅱ相代謝酶，為了測(cè)定肝微粒體中COMT的活性，本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定COMT的底物(原兒茶酸)和其代謝產(chǎn)物(香草酸)含量的HPLC法。該方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，可為COMT相關(guān)研究提供有效的分析手段。

1 材料

1.1 試劑 綠原酸(批號(hào)CAA-111101)購(gòu)自成都天源天然產(chǎn)物有限公司;原兒茶酸(批號(hào) Y-031-132012)和香草酸(批號(hào)X-030-120316)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司;甲醇(Dikma公司，色譜純)，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Ultimate3000型高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司):包括 P680泵、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、UV1700型檢測(cè)器，TC100柱溫箱，Chromeleon工作站。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年的SD大鼠8只，雌雄各半，體重250～300 g，購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SYXK(川)2008-113。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制 分別取原兒茶酸、香草酸對(duì)照品適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、0.75 mg/ml的貯備液。取上述貯備液適量，用甲醇稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液，其中原兒茶酸的質(zhì)量濃度分別為200、100、50、20、10、5 μg/ml，香草酸分別為 150、75、37.5、15、7.5、3.75 μg/ml。取綠原酸(內(nèi)標(biāo))對(duì)照品適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為200 μg/ml的溶液。上述溶液置4℃冰箱，備用。

2.2 肝微粒體的制備與測(cè)定 參考文獻(xiàn)［4］的方法制備大鼠肝微粒，并測(cè)定蛋白濃度。

2.3 色譜條件 色譜柱:Welchrom C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱 溫 30 ℃，流 速 1.0 ml/min;流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸(25∶75);原兒茶酸和香草酸檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)波長(zhǎng)為326 nm。

2.4 樣品前處理方法 取原兒茶酸、香草酸對(duì)照品溶液50 μl，揮干溶劑，加入肝微粒體和 0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)溶液，使終體積為 0.5 ml，蛋白的終濃度為0.5 mg/ml，制成離體肝微粒樣品溶液。

比較3種前處理方法。方法1:向樣品溶液中加入2.0 ml甲醇和50 μl內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋沉淀蛋白3 min。然后以12 000 r/min離心10 min，取出全部上清液，于50℃氮?dú)饬飨麓蹈扇軇瑲埩粑镉?00 μl流動(dòng)相溶解，13 500 r/min離心10 min，取出上清液20 μl進(jìn)樣分析，計(jì)算提取回收率。

方法2:向樣品溶液加入2.0 ml乙酸乙酯和10 μl內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋萃取 3 min，靜止 3 min，取出全部有機(jī)層，于50℃氮?dú)饬飨麓蹈扇軇瑲埩粑镉?00 μl流動(dòng)相溶解，取出 20 μl進(jìn)樣分析。

方法 3:向樣品溶液中依次加入 50 μl(或100 μl)鹽酸(1 mol/L)和 2.0 ml乙酸乙酯，其余操作參照“方法2”。

結(jié)果顯示，“方法3”中 HCl為50 μl時(shí)，原兒茶酸和香草酸的提取率最大(表1)，故本試驗(yàn)選擇該方法作為樣品前處理方法。

表1 3種前處理方法提取回收率結(jié)果比較(%)

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取空白肝微粒體、空白肝微粒體加各對(duì)照品溶液，參照“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法處理和分析樣品。在此條件下，原兒茶酸、內(nèi)標(biāo)和香草酸保留時(shí)間分別為 7.0、9.9 和 14.0 min，理論塔板數(shù)分別大于8100、7400和11 000。各成分達(dá)基線分離，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾(圖1)。

圖1 空白肝微粒體(A)和空白肝微粒體加對(duì)照品(B)的高效液相色譜1：原兒茶酸;2：綠原酸（內(nèi)標(biāo)）;3：香草酸

2.6 線性關(guān)系試驗(yàn) 分別取原兒茶酸和香草酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μl揮干溶劑后，加入肝微粒溶液，每個(gè)濃度樣品一式3份，參照“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法處理和分析樣品。以各底物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比作為縱坐標(biāo)(Y)，以各底物濃度作為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸。同時(shí)以信噪比≥10計(jì)算定量下限(LLOQ)，以信噪比≥3計(jì)算檢測(cè)限(LOD)。結(jié)果顯示，原兒茶酸和香草酸分別在 0.5 ～20 μg/ml和0.375 ～15 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別是 Y=0.1268X-0.0856 和 Y=0.0363X-0.0034;相關(guān)系數(shù)依次是 0.9995 和 0.9999;LLOQ分 別 為 0.05 μg/ml和 0.03 μg/ml;LOD 均 為0.01 μg/ml。

2.7 精密度和回收率試驗(yàn) 制備高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品溶液，每一濃度平行制備5份，參照“2.3”和“2.4”項(xiàng)下方法處理和分析樣品。1 d內(nèi)進(jìn)樣分析，計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。將測(cè)定的底物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入回歸方程，計(jì)算方法回收率。再取同等濃度的各底物和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液，直接揮干溶劑，流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分析，將肝微粒體內(nèi)的底物的標(biāo)峰面積與對(duì)照峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別將低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控溶液置于室溫和-20℃冰箱中保存。置于室溫的樣品分別于24 h和48 h后進(jìn)行測(cè)定，置于-20℃冰箱中的樣品分別于3 d和7 d后測(cè)定含量。結(jié)果顯示，置于室溫的原兒茶酸和香草酸含量的RSD＜2.4% 和 RSD ＜3.2%，置于冰箱的RSD＜9.7%和RSD% ＜10.8%。表明質(zhì)控樣品在室溫48 h內(nèi)穩(wěn)定，在-20℃冰箱7 d內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

關(guān)于COMT活性測(cè)定方法主要包括HPLC(UV［5］、ECD［6］、FD［7］法和 GC-MS 法［8］等。ECD 法靈敏度較高，但檢測(cè)器并不普及;FD法和GC-MS法需要對(duì)樣品進(jìn)行柱前衍生化處理，操作較麻煩。有學(xué)者采用HPLC-UV法測(cè)定COMT活性，但其采用直接沉淀蛋白方法處理樣品，以外標(biāo)法定量。而本試驗(yàn)將樣品酸化提取后再濃縮，這種方法將樣品處理得較干凈，極大地減少了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，避免了殘留蛋白對(duì)色譜柱的污染，而且提高了檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，為了減小操作和儀器誤差給結(jié)果帶來的影響，本試驗(yàn)以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，試驗(yàn)表明綠原酸與待測(cè)物提取率接近，色譜行為相似，適合于原兒茶酸和香草酸的測(cè)定。總之，本試驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，適合于大鼠肝微粒體中COMT活性測(cè)定及相關(guān)研究。

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