不同pH值對人胚肺二倍體成纖維細胞MRC-5生長的影響

陳通威，趙 鵬(山西康寶生物制品股份有限公司，長治 046011;通訊作者，E-mail:ctw001@126.com)

細胞生物學、免疫學以及分子生物學是現代生物學三大前沿學科，細胞培養技術是細胞生物學研究領域中最常用的方法之一。尤其是在生物醫藥領域，許多基因工程藥物、疫苗等都離不開最基本的細胞培養技術，人二倍體細胞系的建立使人用疫苗得到了長足的發展［1］。目前，人胚肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)被國內外很多科研單位和細胞培養工作者使用［2，3］。

在體外培養細胞時，培養液的pH值過高或過低均會對細胞生長產生不利影響。戴永祥等曾經報道過 MRC-5 生長適宜的 pH 值為 7.4［4］，本文對MRC-5的生長pH值范圍進行了擴展研究，找出了適宜MRC-5細胞生長的最佳pH值范圍。在細胞培養過程中，細胞代謝產物的積累會改變培養液的pH值，故常用緩沖液或二氧化碳調節細胞培養液pH值，本文使用7.5%的碳酸氫鈉溶液來調節細胞培養液的pH值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胚肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)，購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，經自行建庫后備用，51萬個/ml。

1.1.2 主要設備、器材與試劑 生化培養箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司。pH計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。倒置顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司。超凈工作臺，北京西泰科隆儀器技術有限公司。數顯恒溫三用水箱，金壇科興儀器廠。高溫電子滅菌爐，SANYO。高壓蒸汽滅菌器，SANYO。滲透儀，WESCOR。T25細胞培養瓶，Nucn。細胞計數板，玉環縣求精醫用儀器廠。

硫酸慶大霉素，4萬 U/ml，天津藥業。MEM，0.95%，GIBCO。胎牛血清，民海生物。谷氨酰胺，高級純，Amresco;配置成0.2 mol/L溶液。胰酶，1∶250，BD;配置成 0.25%溶液。NaHCO3，AR，國藥集團;配置成7.5%溶液。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養液配制 MEM細胞培養液的配制:MEM 935 ml，胎牛血清 50 ml，谷氨酰胺 10 ml，慶大霉素5 ml。將上述溶液分成10份，每份100 ml，取9份，分別滴加不同體積的7.5%NaHCO3調節 pH 值，使培養液的 pH 值分別為 6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6。

1.2.2 細胞復蘇與培養 將配制好的不同pH值細胞培養液各10 ml，加到T25培養瓶中。從液氮中取出凍存的細胞，迅速在37.0℃水浴箱中融化，取適量，分別加入裝有不同pH值培養液的培養瓶中，輕微搖勻，放置在37.0℃生化培養箱中培養。第2天更換細胞培養液，以去除細胞凍存液里的二甲基亞砜(DMSO)，之后繼續放37.0℃生化培養箱中培養。

1.2.3 觀察細胞形態變化 每天用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態，包括細胞的形態、密度、增殖速度等，并拍照記錄，直至細胞長成致密單層為止。

1.2.4 細胞計數 在同一生化培養箱中，37℃培養96 h后，取出培養瓶，倒掉培養液，加入適量的0.25%胰酶消化液，消化半分鐘后倒掉胰酶消化液，作用約5 min直至細胞松散脫落，加入10 ml培養液吹打細胞至分散，制成細胞懸液。顯微鏡下觀察不同pH值培養液中的細胞形態，并用細胞計數板對細胞數量進行計數統計。

細胞計數公式:1 ml細胞數=n個方格細胞數之和×稀釋倍數×10 000/n，計算出不同pH值培養液中每毫升的細胞數。

2 結果

2.1 不同pH值培養液對細胞形態的影響

取出培養的細胞并置于倒置顯微鏡下進行形態觀察，可見當培養液的pH值＜7.0時，MRC-5生長分裂速度緩慢，顯微鏡下細胞為圓球形，懸浮在培養液中(圖1A);當培養液的pH值在7.0－7.1之間時，細胞形態與培養液pH值為7.2－7.3所培養的細胞形態相仿，唯一的區別是細胞分裂生長速度稍慢(圖1B);當培養液的pH值在7.2－7.3之間時，MRC-5細胞分裂較快，增殖速度迅速，細胞形態良好，細胞均勻，呈典型的單一梭形外觀，形成細胞群落(圖1C);當培養液的pH值＞7.4時，MRC-5細胞逐漸停止分裂生長，細胞形態肥大、邊緣不規則，且有部分細胞破碎(圖1D)。

圖1 不同pH值對細胞生長形態的影響Figure 1 Effect of pH on the morphology of MRC-5 cells

2.2 不同pH值培養液對細胞數量的影響

培養96 h后，分別對在pH值為6.8－7.6的培養液中生長的細胞進行計數，結果見表1。表1數據顯示，當培養液的pH值＜7.0時，MRC-5細胞數目較低;當培養液的 pH值在7.0－7.1之間時，細胞數目相對增加;當培養液的pH值在7.2－7.3之間時，MRC-5細胞數目明顯增多，且最高可達2.37×106/ml;當培養液的 pH 值 ＞7.4 時，MRC-5細胞數目明顯降低，可見部分細胞破碎。

3 討論

細胞培養對于基因工程藥物和疫苗的實驗室研究和工業化生產非常重要，而細胞生長的微環境對細胞的影響極大。細胞在體外培養，人們可以有計劃、有選擇、有目標地控制細胞生長的環境，從而可以研究某些特殊條件下的細胞生物學行為。確立細胞培養條件，需要在培養溫度、血清濃度、培養液成分、培養液pH值及培養液滲透壓等方面進行反復實驗。其中pH值對細胞行為的影響最大，也最為關鍵，對細胞工業化生產起著至關重要的作用［1］。

表1 pH對細胞數量的影響 (n=3)Table 1 Effect of pH on cell number of MRC-5 (n=3)

人胚肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)作為國際認可的人二倍體細胞標準株，因用其生產出的生物制品無外源因子、無外源性細胞殘余DNA和無致瘤性。李亞東等報道，在顯微鏡下觀察，MRC-5細胞呈單一梭形，細胞均勻［5］。本文用不同pH值的培養液培養MRC-5細胞，經顯微鏡觀察，分別從細胞形態變化和細胞數量統計兩個方面進行了分析研究，旨在確定MRC-5細胞生長的最佳pH值范圍。

實驗結果表明，當培養液的 pH值 ＜7.0時，MRC-5細胞生長緩慢，形態也不規則;當培養液的pH值在7.0－7.1之間時，細胞的分裂生長速度有所提高，形態也變得規則;當培養液的pH值范圍為7.2－7.3時，最適合 MRC-5生長，細胞形態規則，狀態良好，且增殖速度最快;當培養液的pH值＞7.4時，細胞生長速度變得很慢，甚至停止分裂生長，部分細胞破碎、變形。

通過實驗還可以看出，MRC-5細胞對pH值＞7.4的堿性培養液較敏感，細胞變形嚴重;而對pH值＜7.2的酸性培養液，細胞則其有一定的耐受，故配制細胞培養液時寧可稍偏酸也勿稍偏堿。如果實驗條件允許的話，最好在使用前先測定其pH值，以確保培養液的pH值是在細胞生長的最適范圍內。同時，還應每天注意觀察細胞生長的情況及細胞培養瓶中培養液的顏色變化，以便及時換液或添加NaHCO3。對于條件較好的實驗室，可以直接將細胞培養瓶瓶口微旋，放入CO2孵箱中培養，在飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養條件下培養［6，7］，這樣可以使細胞在整個生長周期中的pH值保持恒定，避免在細胞生長后期因數量多、代謝快而引起細胞培養液的pH值下降，最終導致細胞的脫落和死亡。

細胞培養最適生長條件是實驗成功、企業規?；a的前提，本文對MRC-5細胞培養液的最適pH值范圍進行了科學性和重復性研究，為MRC-5細胞培養后續階段的研究打下堅實的基礎。

［1］ 李元.基因工程藥物［M］.北京:化學工業出版社，2002:82－86.

［2］ 張文娟，紀衛東，楊淋清，等.人胚肺成纖維細胞復制性衰老及過氧化氫誘導的早衰研究［J］.衛生研究，2009，38(2):139－143.

［3］ Saeed K，Pelosi E.Comparison between turnaround time and cost of herpes simplex virus testing by cell culture and polymerase chain reaction from genital swabs［J］.Int J STD AIDS，2010，21(4):298－299.

［4］ 戴永祥，管政德，胡曉玉，等.人二倍體細胞 KMB－17株和MRC-5株生物學性質比較［J］.動物學研究，1985，6(4):313－317.

［5］ 李亞東，牛建昭，王繼峰，等.循環纖維細胞和人胚肺成纖維細胞的比較研究［J］.解剖學報，2007，38(3):300 －303.

［6］ 李映紅，吳正治，吳偉康，等.天然腦活素促細胞增殖和抗細胞衰老作用的研究［J］.深圳中西醫結合雜志，2007，17(6):336－340.

［7］ 婁小燕，孫愛軍，王克強，等.電轉染技術促進人胚肺二倍體成纖維細胞的衰老進程究［J］.上海醫學，2009，32(4):308－311.