兩步融合PCR法構建煙曲霉ssk1基因敲除株

馬 彥，岑 雯，劉 昕，馮文莉(山西醫科大學第二臨床醫學院皮膚科，太原 030001;通訊作者，E-mail:mayan197522@163.com)

近年來隨著新技術的開展和免疫抑制劑的應用，侵襲性曲霉病的發病率在臨床呈現明顯上升趨勢且病死率高，而煙曲霉(Aspergillus fumigates，A.fumigatus)是其主要致病菌，因此探討煙曲霉感染的發病機制變得刻不容緩［1］。通過構建基因敲除株對目的基因進行研究是目前常用來研究煙曲霉的一種方法，既往的實驗技術多數通過克隆技術將指定片段的基因進行敲除，往往受到所選基因序列和載體酶切位點的限制，有時不能完整地敲除整個基因或者指定片段，且耗時較長，本研究通過使用融合PCR法成功構建煙曲霉ssk1基因敲除株，節省時間，大大簡化了煙曲霉基因敲除載體構建的過程，現具體說明如下。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

煙曲霉ku80作為野生對照菌株，煙曲霉轉化用宿主菌為A.fumigatus ku80 pyrG－，該菌株為嘧啶營養缺陷株，在沒有尿苷和尿嘧啶的培養基上不能生長。篩選標記pyrG來源于A.parasiticus(由杜克大學William J.Steinbach教授贈送)。

1.2 培養基

GMM基礎培養基(1 L):20×鹽溶液50 ml，微量元素液 1 ml，D － 葡萄糖10 g，瓊脂15 g(1.5%)，pH 值 6.5。

20 × 鹽溶液(1 L):NaNO3120 g，KCl 10.4 g，MgSO4·7H20 10.4 g，KH2PO430.4 g，加水至 1 L，室溫儲存。

微量元素液(1 L):ZnSO4·7H20 2.2 g，H3BO31.1 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.5 g，CoCl2·5H2O 0.16 g，CuSO4·5H2O 0.16 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11 g，Na4EDTA 5.0 g。

溶壁酶:Vinoflow FCE(Novozymes公司);等滲培養基:1.2 mol/L MgSO4，10 mmol/L sodium phosphate，4 ℃保存;Trapping 緩沖液:0.6 mol/L sorbitol，0.1 mol/L Tris－HCl，4 ℃保存;STC 溶液:1.2 mol/L sorbitol，10 mmol/L CaCl2，10 mmol/L Tris － HCl pH 7.5，在4℃保存;聚乙二醇氯化鈣溶液:60%PEG，50 mmol/L CaCl2，50 mmol/L Tris－HCl pH 7.5在室溫保存;1.5%底層瓊脂培養基(SMM)∶20×鹽溶液50 ml，微量元素液1 ml，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，山梨醇218.6 g，酵母提取物 1 g，pH 值6.5，加水至 1 L，高壓滅菌20 min。0.7%頂層瓊脂培養基:配方同上(1.5%)，將其中瓊脂改為7 g/L。

1.3 生物信息學分析

在煙曲霉基因組中(www.aspergillusgenome.org)找出與念珠菌ssk1基因同源的基因，并利用SMART軟件對此基因功能區進行初步分析。

1.4 煙曲霉ssk1基因敲除的構建

1.4.1 基因敲除的構建 煙曲霉ssk1基因敲除構建示意圖見圖1。

圖1 ssk1基因敲除構建示意圖Figure 1 Sketch map of ssk1gene deletion

1.4.2 引物 本實驗中所用引物見表1。

1.4.3 基因片段的擴增與融合 本實驗采用了兩輪PCR反應，其體系及反應條件如下。

第一輪PCR:以野生株基因組DNA為模板，首先分別使用F1、R1;F2、R2擴增相應的片段。以A.parasiticus DNA為模板使用引物pyrG－5’，pyrG－3’擴增篩選標記pyrG。具體PCR擴增體系及反應條件如下(試劑盒為NEB公司高保真融合PCR DNA 聚合酶):無核酸酶的水31.5 μl，5 × 緩沖液10 μl，10 mmol/L dNTPs 1 μl，10 μmol/L 上游引物 2.5 μl，10 μmol/L 下游引物2.5 μl，模板 DNA(濃度100 ng/μl)2 μl，高保真融合 PCR DNA 聚合酶 0.5 μl，合計 50 μl。

反應條件:98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，60 ℃30 s，72℃1 min，共30個循環。72℃ 10 min，4℃保存。

該反應中F1、R1，F2、R2擴增相應序列片段均為1.0 kb。因為擴增條帶大小相等，且退火溫度差別不大，故使用相同的擴增條件，產物標記為P1，P2。擴增篩選標記 pyrG:使用引物 pyrG－5’和pyrG －3’，產物大小約為 2.3 kb，體系同前，PCR 反應條件中延伸時間改為2 min，產物標記為P3。

表1 本研究中所使用的引物序列Table 1 Sequences of the primer in this study

0.8 %瓊脂糖凝膠電泳，確定片段大小，并切膠純化。純化用試劑盒為:Fermentas公司的Gene JET gel extraction kit。

第二輪PCR反應:也是最重要的一步反應即融合基因的擴增。其反應體系及反應條件如下:無核酸酶的水 30.5 μl，5 × 緩沖液 10 μl，10 mmol/L dNTPs 1 μl，10 μmol/L 上游引物 2.5 μl，10 μmol/L下游引物 2.5 μl，模板 DNA 3 μl，高保真 DNA 聚合酶 0.5 μl，體系合計 50 μl。其中模板 DNA 為 P1，P2，P3三種產物各取1 μl的混合體，將延伸條件改為4 min進行擴增。其反應條件如下:98℃ 10 s，60℃ 30 s，72 ℃ 4 min共1個循環，98 ℃ 10 s，62 ℃30 s，72℃ 4 min，共29個循環。72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

0.8 %瓊脂糖凝膠電泳，對比Marker確定正確大小的融合基因片段，切膠純化，并定量(試劑同前)。

1.4.4 原生質體法構建基因敲除株 250 ml基礎培養基+0.5% 酵母提取物+尿苷尿嘧啶(Uracil 0.14 g，Uridine 0.315 g)接種 Δku80 pyrG－菌懸液 2 ml，30 ℃，250 r/min搖床過夜培養(16 －20 h)。收集菌絲，使用Vinoflow FCE稱量3 g，放于干凈的40 ml等滲培養基中，充分吹打混勻。28℃，75 r/min搖床培養3－4 h。加入Trapping緩沖液4℃，3 500 r/min離心10 min;吸出離心管夾層的原生質體，加3倍體積的STC溶液到原生質體中，上下輕輕顛倒混勻，離心。吸出原生質體層，用1 ml的STC溶液重懸原生質體，觀察原生質體狀態及濃度，適當調整濃度。取5 μg的融合PCR產物加入到200 μl的原生質體中，冰上靜置1 h。將200 μl DNA－原生質體放入到1.25 ml的聚乙二醇氯化鈣溶液中，輕彈混勻，室溫放置20 min，加入3 ml STC，輕輕混勻，取300 μl與10 ml SMM頂層培養基混合后鋪板于1.5%的底層培養基上，放置于37℃孵箱中培養。具體實驗方法見文獻［2］。

1.5 轉化子的驗證

1.5.1 PCR驗證 在GMM液體培養基中過夜培養單克隆轉化子，并提取基因組DNA。分別使用四組引物進行擴增(F1，R4;F4，R2;F1，pyrG －3’;R2，pyrG －5’)。

擴增體系及反應條件如下:無核酸酶的水7 ul，2 × 緩沖液 10 μl，10 μmol/L 上游引物 0.5 μl，10 μmol/L 下游引物 0.5 μl，模板 DNA(濃度 100 ng/μl)2 μl，合計 20 μl。反應條件:95℃ 5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環。72 ℃延伸10 min，4℃保存。其中延伸溫度根據擴增片段大小適當調整。所用試劑為Thermo scientific Dream taq Green PCR Master mix(2×)。

1.5.2 Southern Blot驗證轉化子 提取轉化子基因組DNA，使用ApaLⅠ過夜酶切，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，具體實驗步驟按照試劑盒說明。所用試劑Roche公司的地高辛標記SouthernBlot試劑盒。

2 結果

2.1 煙曲霉ssk1基因生物學分析

通過同源基因的序列比對我們在煙曲霉基因組中找到其同源基因為Afu5g08390，位于5號染色體，編碼850個氨基酸，Smart軟件分析發現在560－718氨基酸間存在信號傳導受體區。序列同源性比較結果:黃曲霉相似性81%，土曲霉相似性73%，黑曲霉73%，構巢曲霉72%，白念珠菌71%，裂殖酵母75%。

2.2 PCR 擴增結果

第一步PCR擴增結果見圖2，可見分別獲得了大約1.0 kb的ssk1基因的上下游側翼序列。圖3可見獲得了大小約為2.3 kb的片段，為篩選標記pyrG。第二步融合PCR擴增結果可見有數條高亮條帶(見圖4)，其中大約為4.3 kb的片段為我們的目的片段。

圖2 ssk1基因上下游側翼序列PCR擴增結果Figure 2 PCR amplification results of the flanking sequence of the ssk1 gene

圖3 篩選標記pyrG基因擴增結果Figure 3 PCR amplification results of the pyrG gene using the primer pyrG －5’and pyrG －3’

圖4 融合基因PCR擴增結果Figure 4 PCR amplification results of the fushion PCR using the primer F1 and R2

2.3 轉化子PCR鑒定結果

原生質體法轉化煙曲霉后挑取單克隆的轉化子在GMM液體培養基中進行培養，提取DNA鑒定。我們共使用四組引物進行擴增驗證。

第Ⅰ組使用引物F1、R4進行擴增:由于R4引物設計在基因上，因此在野生株應該出現條帶約為2 494 bp，在基因敲除株無條帶出現。菌株1，3，4，5無條帶出現為正確的基因敲除株，而轉化子2和野生株有條帶(見圖5)，說明轉化子2不是正確的基因敲除株。

第Ⅱ組使用F4、R2進行擴增分別擴增轉化子。由于F4引物設計在基因上，因此在野生株可以出現條帶約為2 332 bp，在基因敲除株無條帶出現。由圖5可見轉化子1，3，4，5無條帶出現為正確的基因敲除株，而轉化子2和野生株有條帶，說明轉化子2不是正確的基因敲除株。

第Ⅲ組使用F1、pyrG－3’這對引物進行擴增。由于pyrG－3’在篩選標記上，因此在野生株沒有條帶出現，在基因突變株有條帶大約1.0 kb，由圖5可見在野生株上無條帶出現，而在轉化子 1，2，3，4，5都有正確大小的條帶出現，說明均有篩選標記進入到轉化子中。

第Ⅳ組使用pyrG－5’、R2這對引物進行擴增。由于pyrG－5’在篩選標記上，因此在野生株沒有條帶出現，在基因突變株有條帶大約3.5 kb的條帶。由圖6可見在轉化子1，2，3，4，5都有正確條帶出現說明均有篩選標記進入到轉化子中。

綜上可見1，3，4，5這四個轉化子為同源轉化子，而轉化子2為異源轉化子，也就是沒有結合到正確的位置上。

圖5 野生株與轉化子的PCR結果Figure 5 PCR results of wild strain and transformants

2.4 Southern blot驗證結果

根據PCR的結果我們進一步驗證了轉化子1，3，4，5的正確性。從基因敲除構建的示意圖我們可以看出在野生株使用限制性內切酶ApaLⅠ酶切后得到大約4 806 bp大小的片段，而在基因敲除株則得到大約2 110 bp大小的片段(見圖7)，進一步說明得到的轉化子1，3，4，5是正確的轉化子。

3 討論

由于煙曲霉致病引起的侵襲性曲霉病發病明顯增加，致力于煙曲霉研究的學者也越來越多，而目的基因的特異性敲除是一種常用的研究方法。既往的研究顯示多數學者采取了質?？寺〉姆椒ǎ?］，為了提高煙曲霉轉化的效率，近年來使用根癌農桿菌介導的煙曲霉的轉化方法有效地提高了轉化效率［3，4］。然而構建敲除載體的過程仍然復雜，需要精心選擇酶切位點并構建多個中間載體，耗時較長，且受到載體種類和酶切位點的限制，往往造成有些基因序列不能順利構建載體，延長了研究周期。

圖7 使用Southern blot對轉化子進行驗證Figure 7 The verification of the transformants using Southern blot

近年來很多學者嘗試改變構建載體的方法，以更簡潔、更方便的方法來替代傳統的方法。融合基因法陸續有人報道［5，6］。融合 PCR(fusion PCR)是將任意兩條或三條具有同源區域的片段，通過PCR的方法實現連接的技術方法，融合PCR作為一種常用的構建重組片段或重組載體的手段常用于基因功能研究，而隨著越來越多的基因組被測序出來，對目的基因進行多種功能分析成為可能，如目的基因特異性敲除、目的基因過量表達或體外表達，或者對目的基因插入熒光標記等。絲狀致病真菌煙曲霉基因敲除本身有一定的難度，有研究報道在雙相真菌馬爾尼菲青霉的載體構建中有通過使用三步融合PCR法構建成功的報道［7］。煙曲霉基因敲除載體的構建近期也有人報道使用三步融合PCR的方法［8，9］，本實驗中，不同于以往報道的三步融合基因法，采用兩步融合法。

首先，在引物設計時只是在特異基因的上下游側翼序列同要融合的基因即篩選標記相鄰片段的引物上設計了15個堿基的互補序列(見表1中的紅色標記序列)，并沒有在篩選標記pyrG的上下游引物上設計與要融合的上下游側翼序列相鄰片段的互補序列，這樣設計的好處是篩選標記的引物可以用途更廣，在構建以pyrG為篩選標記的其他基因敲除載體時都可以使用該對引物擴增篩選標記，更具有通用性，也節約了實驗成本和時間，只需要針對特異的基因要融合的片段設計特異的引物序列即可。

其次，第二步融合PCR反應中將不同來源的基因模板融合形成全長的過程和擴增合并在一起進行。有文獻報道先在不添加引物的情況下使用DNA聚合酶進行片段的互補延伸產生中間產物，然后用中間產物作為模板再進行全長序列的擴增［10］;還有文獻則先將上下游序列同篩選標記融合產生中間產物再通過一次巢氏PCR的方法獲得全長融合基因［9］。我們直接將三種片段產物進行融合擴增，減少了一次PCR的反應過程，縮短了實驗時間。在這里我們使用的三種模板的體積比為1∶1∶1，融合過程中各片段在體系中的濃度不同的學者有不同的見解。韓改革等認為各片段在反應體系中的終濃度≥15 ng/μl且摩爾比為 1∶1∶1 時較易獲得產物［8］，而劉增然等認為上下游產物以及篩選標記產物的比例為1∶1∶3也能獲得較好的效果［9］。我們的經驗是體積比為1∶1∶1，在其他基因敲除的過程中也取得了較好的效果。不同于上述兩位作者，他們都采用了三步法進行融合PCR擴增，而我們的試驗中只使用了兩步也能成功獲得融合的目的片段。在這個PCR反應條件中我們的第1個循環就是將模板相互融合的過程。這樣做減少了實驗步驟，只要通過兩次PCR實驗即可擴增出需要的融合片段，純化后，進行煙曲霉轉化，不同于克隆質粒，需要進行培養，大大節約了時間。我們進行兩步PCR融合基因法構建煙曲霉ssk1的基因突變株發現融合PCR的特異性可能會差一些，因此出現的條帶較多，合理調整PCR的反應條件是比較重要的。如果擴增的目的片段偏弱可以適當降低第1個循環中的退火溫度，在第2－29個循環中退火溫度適當提高可以增加產物的特異性，當然不同的基因和引物可能需要的條件不同。如果條帶不清晰則需要重新調整反應條件，進一步優化。不同的實驗室根據自己的經驗可能有不同的方案。

總之，融合PCR這種技術在構建煙曲霉基因敲除株的好處在于其不受序列本身和載體酶切位點的限制，在沒有合適的載體或者酶切位點時進行基因敲除，融合PCR的方法不失為煙曲霉基因敲除的一個很好的策略。我們通過使用融合PCR技術得到了煙曲霉ssk1基因的全基因敲除株，這為我們的下一步的實驗提供了良好的平臺。

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