mGluR5拮抗劑MPEP抑制大鼠NPCs增殖

趙雪超，韓 佳，郭 波，童東東，王曉霏，趙凌宇(西安市北方醫院康復科，西安 70043;西安交通大學醫學院醫學遺傳學與分子生物學系;通訊作者，E-mail:lingyuzhao@aliyun.com)

神經祖細胞(neural precursor cells，NPCs)具有自我更新、不斷增殖及多向分化潛能的生物學特性［1］。NPCs存在于哺乳動物發育期和成熟期的中樞神經系統(central nervous system，CNS)中［2］。目前，NPCs已經被研究用來治療帕金森氏病、Huntington病、缺血性中風、脫髓鞘病及腦、脊髓損傷等CNS疾病，NPCs治療已經被廣泛認為能改善腦缺血、神經損傷和神經變性紊亂疾病后的神經功能［3，4］。在NPCs替代治療過程中，基因調控對NPCs的增殖起著非常重要的作用。因此，闡明NPCs增殖的分子機制在修復神經系統損傷和治療神經退行性疾病方面有非常重要的作用。

研究報道，谷氨酸可能通過代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)調控腦損傷后的神經發生［5］。mGluRs包括8種成員，分別是mGluR1－8，分為三組，其中 mGluR5屬于Ⅰ組mGluRs。Castiglione等［6］研究報道，mGluR5 可促進成年側腦室下區(subventricular zone，SVZ)的NPCs存活和增殖。2－甲基－6－(苯乙炔)吡啶鹽酸鹽［6－methyl－2－(phenylethynyl)pyridine hydrochloride，MPEP］是一個非競爭性的mGluR5拮抗劑，為研究不同疾病動物模型提供了一個有效的選擇性的系統的活性化合物，它可以抑制 mGluR5 的激活［6，7］。NPCs的增殖和分化受到多個信號轉導通路的調控，RAS MAPK信號轉導通路就參與了NSCs的增殖和分化過程。ERK，JNK和 p38 MAPKs是主要的MAPK家族成員，它們在CNS發育和分化過程中扮演著重要的角色［8］。本實驗應用mGluR5的特異性拮抗劑MPEP，分析MPEP對大鼠 NPCs增殖的影響，觀察ERK，JNK和p38 MAPKs信號通路激活的變化，探討MPEP抑制大鼠NPCs增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague－Dawley(SD)大鼠由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。孕鼠飼養至受孕后15 d，分離胚胎鼠，進行大鼠胚胎NPCs培養。

1.2 主要試劑

DMEM/F12(1∶1)培養基、N2 添加劑、B27 添加劑、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購于美國Gibco公司;MPEP、表皮生長因子(EGF)、肝素、MTT、RnaseA、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)購于美國Sigma公司;AnnexinⅤ－FITC凋亡試劑盒購于美國BD Bioscience公司;兔抗大鼠ERK1/2多克隆抗體、兔抗大鼠P-ERK 1/2多克隆抗體、小鼠抗大鼠JNK2單克隆抗體、小鼠抗大鼠P-JNK單克隆抗體、小鼠抗大鼠p38單克隆抗體、兔抗大鼠P－p38單克隆抗體均購于美國Cell Signaling公司;ECL化學發光底物試劑盒購于美國Pierce公司;RIPA裂解液購于碧云天公司。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱Galaxy S(英國RS Biotech公司);高通量多功能微板測試系統(德國 BMG Labtechnologies公司);倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司);低速離心機TDL－5(上海安亭科學儀器廠);FASCalibar流式細胞儀(美國 FALS CALIBAR BD公司);GBOX－HR全自動凝膠成像分析系統(英國SYNGENE公司);濕法蛋白電轉印系統DYCZ－40D(北京六一儀器廠);水平電泳儀DYCZ－31N(北京六一儀器廠);垂直電泳系統SE260(美國Amersham公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠胚胎皮質NPCs的分離和培養 取孕15 d大鼠，麻醉，取出胚胎，將分離的腦組織移到基礎培養基(DMEM/F12)中;剝離腦膜，分離大腦皮質，然后用基礎培養基洗滌2次;將分離的大腦皮質快速剪50次，使組織分散為小塊，移入消化液中，置入37℃培養箱，消化細胞5 min;加入胰蛋白酶抑制劑終止消化，用吸管吹打100－150次，使組織分散為單細胞;用200目篩網過濾;將獲得的細胞懸液移至離心管中，800 r/min離心5 min，棄掉上清液;再用基礎培養基洗細胞1次;用完全培養基(DMEM/F12基礎培養基中加入20 ng/ml EGF，10 ng/ml bFGF，1 × B27 supplement，1 × N2 supplement，100 U/ml鏈霉素，100 U/ml青霉素，0.4 U/ml肝素)重懸細胞;將細胞密度調節為1×105/ml，按照4 ml/瓶將細胞種入T50培養瓶中，置入37℃，5%CO2孵箱中培養，第2天每瓶細胞補加1 ml完全培養基，培養5－7 d后傳代培養(本研究所用的NPCs均為傳1代的細胞)。

1.4.2 MTT比色法檢測MPEP對大鼠NPCs增殖的影響 將傳1代的NPCs按照約20 000個/孔種入96孔板中，每孔為200 μl的單細胞懸液，正常培養2 d后加藥物干預。實驗分組:對照、MPEP(1 μmol/L)、MPEP(10 μmol/L)和 MPEP(100 μmol/L)組。加入藥物后繼續分別培養1，2，3 d。培養細胞在收獲前4 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，使MTT的終濃度為0.5 mg/ml，然后繼續于孵箱中培養至收獲時間。1 000 r/min離心5 min棄去培養上清液，再加入150 μl DMSO，震蕩5 min，促使結紫色晶充分溶解。在POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測光吸收值，檢測波長為490 nm。

1.4.3 測量神經球直徑分析MPEP對大鼠 NPCs神經球增長的影響 將傳1代的NPCs按照約20 000個/孔種入96孔板中，每孔為200 μl的單細胞懸液，放入37℃，5%CO2孵箱中培養2 d后加藥物干預。實驗分組同上。加入藥物后繼續分別培養1，2，3 d。培養細胞在各時間點時，利用倒置相差顯微鏡，在200倍鏡下每孔按時鐘的3點、6點、9點、12點和圓心5個方位選取5個視野，用Image-Pro Express(IPP)圖像分析軟件照相并分析比較各組神經球直徑的變化。

1.4.4 流式細胞儀檢測MPEP對大鼠NPCs細胞周期的影響 將傳1代的NPCs按照約200 000個/孔種入6孔板中，每孔為2 ml的單細胞懸液，培養2 d后加藥物干預。實驗分組:對照組、MPEP(100 μmol/L)組。加入藥物后繼續培養2 d后，收集各組神經球，用復合消化液消化，300目篩網過濾，收集單細胞懸液;800 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗滌1次;加入250 μl PBS以重懸細胞，再逐滴加入750 μl無水乙醇并同時不斷搖動離心管，從而使酒精濃度緩慢上升，其終濃度為75%，放置4℃過夜固定;PBS洗滌1次;加入濃度為100 μg/ml的無DNase的RNaseA 0.5 ml，重懸細胞;再加入濃度為100 μg/ml PI染液 0.5 ml，混合均勻，室溫下避光孵育15 min;用流式細胞儀(FACS)檢測，每個樣品檢測細胞數量為2×104個，激發波長為488 nm，PI的紅色熒光通過630 nm的濾光片收集，用BD FACSort Cell Quest軟件獲取數據，最后用Modfit LT軟件分析DNA的含量變化。

1.4.5 AnnexinⅤ －PI法檢測 MPEP對大鼠 NPCs細胞凋亡的影響 傳1代的NPCs按照約200 000個/孔種入6孔板中，培養2 d后加藥物干預(MPEP 100 μmol/L)，繼續培養2 d后，消化，制備成單細胞懸液，PBS洗滌2次。用250 μ1結合緩沖液重新懸浮細胞，使其濃度為1×105/ml。加100 μ1的細胞懸液入5 ml流式管中，每管加入5 μ1 AnnexinⅤ/FITC 和 5 μ1 20 μg/ml的碘化丙錠，避光混勻，標記15 min。在流式管中加入400 μ1 PBS。用流式細胞儀(FACS)檢測，光源為488 nm氬離子激光器，FITC受激發后發綠色熒光，PI發紅色熒光，結果用隨機軟件分析。

1.4.6 免疫蛋白印跡 (Western blot)分析 MPEP對MAPKs信號通路的影響 傳1代的NSCs培養1 d后，加藥物干預(MPEP 100 μmol/L)，繼續培養1 d，置入RIPA細胞裂解液中，低溫裂解細胞30 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液。以BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白煮沸變性。取50 μg總蛋白，在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，電轉移至硝酸纖維素膜上，依分子量大小切取條帶，加入封閉液室溫下震蕩2 h后，取相應條帶分別加入兔抗大鼠ERK1/2多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗大鼠P-ERK 1/2多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、小鼠抗大鼠JNK2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、小鼠抗大鼠P-JNK2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、小鼠抗大鼠p38 MAPK單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗大鼠P-p38 MAPK單克隆抗體(1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次。然后與HRP標記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(1∶2 500稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入免疫印跡化學發光劑，置于Syngene G Box凝膠成像儀的暗箱中拍照。應用英國SYNGENE公司的GeneTools軟件分析，計算條帶的積分光密度(optic density，OD)值，半定量分析。所有細胞實驗重復3次。

1.5 統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析，各組實驗數據均以±s表示，用單因素方差分析(One-Way，ANOVA)進行總體差異的檢驗，應用GraphPad Prism 5軟件進行繪圖。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MPEP對大鼠NPCs增殖的影響

應用MTT比色法分析了mGluR5拮抗劑MPEP(1，10，100 μmol/L)分別在處理大鼠 NPCs 1，2，3 d后對細胞增殖活力的影響。與對照組比較，MPEP 100 μmol/L 分別在作用1，2，3 d 后降低了 NPCs增殖活力(P ＜0.01，圖 1);與1 μmol/L MPEP 組及10 μmol/L MPEP 組相比較，100 μmol/L MPEP 組 NPCs增殖活力顯著下降(均 P＜0.05);1 μmol/L MPEP組及10 μmol/L MPEP組與對照組之間無顯著差異。神經球直徑測量結果顯示，100 μmol/L MPEP分別在作用1，2，3 d后神經球的平均直徑依次為(48.65 ±4.12)μm，(61.39 ±5.23)μm，(74.96 ±5.79)μm，與對照組相比神經球均顯著減小(P＜0.05，圖 2);與 1 μmol/L MPEP 組及 10 μmol/L MPEP組相比較，100 μmol/L MPEP組神經球顯著減小(均P ＜0.05);1 μmol/L MPEP 組及10 μmol/L MPEP組與對照組之間無顯著差異。

2.2 MPEP對大鼠NPCs細胞周期的影響

圖1 MPEP對大鼠NPCs增殖的影響(MTT比色分析)Figure 1 Effect of MPEP on rat NPC proliferation by MTT assay

圖2 MPEP對大鼠神經球增殖的影響(神經球直徑測量)Figure 2 Effect of MPEP on rat neurosphere diameters

將培養的神經球用藥物處理2d后，消化分散為單個細胞，應用流式細胞儀檢測細胞周期。mGluR5拮抗劑MPEP(100 μmol/L)組與對照組相比，G0/G1期細胞數量顯著增加(P＜0.01)，S期細胞數量顯著減少(P＜0.01)，G2/M期細胞數量也有減少，表明mGluR5拮抗劑MPEP將大鼠NPCs阻滯在G0/G1期，抑制了細胞進入S期進行DNA復制(見圖 3)。

圖3 MPEP對大鼠NPCs細胞周期的影響Figure 3 Effects of MPEP on cell cycle of rat NPCs

2.3 MPEP對大鼠NPCs凋亡的影響

培養的神經球用藥物處理2 d后，消化分散為單個細胞，應用AnnexinⅤ+PI試劑盒染色，流式細胞儀檢測分析。對照組正常細胞為(87.25±4.78)%，早期凋亡細胞為(6.46 ±1.89)%，晚期凋亡細胞為(3.37±1.55)%。與對照組相比，mGluR5拮抗劑MPEP組正常細胞顯著減少(P＜0.01)，為(60.78±4.22)%;早期凋亡細胞顯著增加(P＜0.01)，為(23.45 ±2.45)%;晚期凋亡細胞也明顯增加(P ＜0.01)，為(11.83 ±2.23)%;壞死細胞沒有顯著差異(見圖4)。

圖4 MPEP對大鼠NPCs凋亡的影響Figure 4 Effect of MPEP on apoptosis of rat NPCs

2.4 MPEP抑制大鼠NPCs MAPKs信號通路的激活

應用Western blot分析MPEP對大鼠NPCs內的MAPKs信號通路的3個主要成員ERK、JNK和p38的磷酸化激活的影響。結果顯示，體外培養的大鼠NPCs內總的ERK、JNK和p38表達水平無顯著性差異(見圖5)。應用P-ERK1/2比總ERK1/2、P-JNK2比總JNK2、P－p38比總p38光密度積分比值來表示ERK1/2、JNK2和p38激活的變化，達到了半定量分析的目的。結果顯示，與對照組相比，MPEP組的ERK1/2和JNK2的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，但是p38的磷酸化水平顯著增高(P＜0.05，圖5)。

3 討論

mGluR5在調節成年人側腦室下區(SVZ)NPCs的存活和增殖中發揮著重要作用。研究報道，在大鼠胚胎期的所有腦區均有mGluR5蛋白表達，在出生后的腦部神經發生區也有表達［9］。Di Giorgi Gerevini等［10］研究發現，mGluR5 在培養的小鼠 NPCs中有表達并且具有生物學活性，當利用阻斷劑阻斷這兩種受體以后，結果發現NPCs的增殖與存活明顯減少，但是將mGluR5激活以后，能夠顯著地促進細胞增殖。在基因敲除mGluR5的成年小鼠或利用阻斷劑阻斷mGluR5以后，在側腦室下區(SVZ)和齒狀回顆粒下層(SGZ)區域增殖的NPCs數量顯著降低。這些研究證明mGluR5能夠調控NPCs的存活與增殖。在本試驗中，MPEP通過抑制mGluR5激活，降低了體外培養的大鼠NPCs的細胞活力和神經球的大小，表明MPEP可顯著的抑制體外培養的大鼠胚胎皮質NPCs增殖。

圖5 MPEP對大鼠NPCs的MAPKs信號通路磷酸化水平的影響(與對照組比較，*P＜0.01)Figure 5 Effects of MPEP on phosphorylated-MAPKs expression of rat NPCs(*P ＜0.01 vs control group)

細胞周期中從G1到S期的轉換是調節細胞周期的最主要作用節點，在細胞跨越G1/S節點后，細胞周期將依照細胞周期內部的程序進行，逐漸回到G1期前，在這個階段將不容易受到其他增殖調控因素的影響［11］。M期細胞的比例大小，可以表明處于增殖分裂期細胞的多少。S期細胞所占比例大小可以表明開始新一輪DNA復制合成和分裂的細胞數量的多少。在正常培養的NPCs中，大部分細胞處于靜息期(約80%)，只有大約20%的細胞處于DNA復制合成期和分裂期。在 mGluR5拮抗劑MPEP處理NPCs后，細胞的DNA復制合成與細胞分裂顯著減少。因此，推測MPEP可能通過抑制mGluR5，影響NPCs的DNA復制合成與細胞分裂來抑制NPCs的增殖。

RAS-MAPK信號轉導通路涉及到多種生物學和生理學的進程，例如細胞增殖、存活、凋亡、分化和轉化。ERK，JNK和p38 MAPKs是主要的MAPK家族成員，在CNS發育和分化過程中扮演著一個重要的角色［12］。據報道，mGluR Ⅰ組激動劑3，5－ 二羥基苯甘氨酸(DHPG)可以刺激體外的皮質神經元的ERK1/2 的磷酸化激活［13］。Tian 等［14］報道激活mGluR7，可能通過影響RAS MAPK信號轉導通路磷酸化激活促進 NPCs增殖和分化。ERK是一個mGluR5的下游調節子［15］。ERK1/2級聯反應在CNS結構和功能改變過程中通過調節細胞活動和基因轉錄來轉導細胞內和細胞外信號活動［16］。有研究報道表明，JNK2也調節NPCs的增殖［17］。在本研究中，我們發現mGluR5的拮抗劑MPEP下調了體外培養的大鼠NPCs的p－ERK和p－JNK表達。因此，我們推測MPEP抑制 mGluR5后通過抑制ERK和JNK信號轉導通路來抑制NPCs的增殖。有研究表明mGluR5的激活通過增加EGF受體酪氨酸自磷酸化致使EGF受體處于動態的轉活狀態，這依次激活下游的信號通路進而上調JNK的磷酸化［18］，這與我們的研究一致。

p38的磷酸化激活能夠誘導細胞凋亡，用p38的選擇性抑制劑SB203580能減少細胞的死亡［19］。Kim等［20］的研究表明p38 MAPK信號通路在NPCs增殖上起著負調節因子的作用。本研究中，用MPEP處理大鼠NPCs后，p38 MAPK的磷酸化水平上調，細胞凋亡增加。這些結果說明mGluR5拮抗劑MPEP可以通過調節p38 MAPK信號通路的磷酸化水平增加大鼠胚胎皮質NPCs的凋亡。

總之，mGluR5拮抗劑MPEP通過抑制ERK和JNK的磷酸化激活抑制體外培養的大鼠胚胎皮質NPCs增殖，促進了細胞凋亡。然而，關于mGluR5下游的級聯反應是非常復雜的，需要進一步探討mGluR5調控NPCs增殖的確切分子機制。

［1］ Santilli G，Lamorte G，Carlessi L，et al.Mild hypoxia enhances proliferation and multipotency of human neural stem cells［J］.PLoS One，2010，5:e8575 － e8586.

［2］ De Filippis L，Delia D.Hypoxia in the regulation of neural stem cells［J］.Cell Mol Life Sci，2011，68:2831 －2844.

［3］ Marshall CT，Lu C，Winstead W，et al.The therapeutic potential of human olfactory － derived stem cells［J］.Histol Histopathol，2006，21:633 －643.

［4］ Chaturvedi RK，Shukla S，Seth K，et al.Zuckerkandl’s organ improves long－term survival and function of neural stem cell derived dopaminergic neurons in Parkinsonian rats［J］.Exp Neurol，2008，210:608 －623.

［5］ Schlett K.Glutamate as a modulator of embryonic and adult neurogenesis［J］.Curr Top Med Chem，2006，6(10):949 －960.

［6］ Castiglione M，Calafiore M，Costa L，et al.Group I metabotropic glutamate receptors control proliferation，survival and differentiation of cultured neural progenitor cells isolated from the subventricular zone of adult mice［J］.Neuropharmacology，2008，55:560－567.

［7］ Gasparini F，Lingenhohl K，Stoehr N，et al.2 － Methyl－ 6 －(phenylethynyl)－ pyridine(MPEP)，a potent，selective and systemically active mGlu5 receptor antagonist［J］.Neuropharmacology，1999，38:1493 －1503.

［8］ Yang SR，Cho SD，Ahn NS，et al.The role of p38 MAP kinase and c－Jun N－terminal protein kinase signaling in the differentiation and apoptosis of immortalized neural stem cells［J］.Mutat Res，2005，579:47 －57.

［9］ Cappuccio I，Spinsanti P，Porcellini A，et al.Endogenous activation of mGlu5 metabotropic glutamate receptors supports self－renewal of cultured mouse embryonic stem cells［J］.Neuropharmacology，2005，49(Suppl 1):196 －205.

［10］ Di Giorgi－ Gerevini V，Melchiorri D，Battaglia G，et al.Endogenous activation of metabotropic glutamate receptors supports the proliferation and survival of neural progenitor cells［J］.Cell Death Differ，2005，12(8):1124 －1133.

［11］ Liu KJ，Hoopes PJ，Rolett EL，et al.Effect of anesthesia on cerebral tissue oxygen and cardiopulmonary parameters in rats［J］.Adv Exp Med Biol，1997，411:33 －39.

［12］ Yang SR，Cho SD，Ahn NS，et al.The role of p38 MAP kinase and c－Jun N－terminal protein kinase signaling in the differentiation and apoptosis of immortalized neural stem cells［J］.Mutat Res，2005，579:47 －57.

［13］ Wang Y，Zheng F，Zhou X，et al.Converging signal on ERK1/2 activity regulates group I mGluR－mediated Arc transcription［J］.Neurosci Lett，2009，460:36 － 40.

［14］ Tian Y，Liu Y，Chen X，et al.AMN082 promotes the proliferation and differentiation of neural progenitor cells with influence on phosphorylation of MAPK signaling pathways［J］.Neurochem Int，2010，57:8 －15.

［15］ Yang L，Mao L，Tang Q，et al.A novel Ca2+－ independent signaling pathway to extracellular signal regulated protein kinase by coactivation of NMDA receptors and metabotropic glutamate receptor 5 in neurons［J］.J Neurosci，2004，24(50):10846 －10857.

［16］ Valjent E，Corvol JC，Trzaskos JM，et al.Role of the ERK pathway in psychostimulant－ induced locomotor sensitization［J］.BMC Neurosci，2006，7:20 －32.

［17］ Chen X，Tian Y，Yao L，et al.Hypoxia stimulates proliferation of rat neural stem cells with influence on the expression of Cyclin D1 and c-Jun N-terminal protein kinase signaling pathway in vitro［J］.Neuroscience，2010，165:705 － 714.

［18］ Yang L，Mao LM，Chen H，et al.A signaling mechanism from G qprotein-coupled metabotropic glutamate receptors to gene expression:role of the c-Jun N-terminal kinase pathway［J］.J Neurosci，2006，18:971 －980.

［19］ Kim HJ，Oh JE，Kim SW，et al.Ceramide induces p38 MAPK-dependent apoptosis and Bax translocation via inhibition of Akt in HL － 60 cells［J］.Cancer Lett，2008，260:88 － 95.

［20］ Kim J，Wong PK.Loss of ATM impairs proliferation of neural stem cells through oxidative stress－mediated p38 MAPK signaling［J］.Stem Cells，2009，27:1987 －1998.