豆渣蛋白肽的酶解工藝、抗氧化作用及其特性研究

高義霞 周向軍 魏葦娟 馬子真 孫龍龍

(天水師范學院生命科學與化學學院，天水 741001)

中國是世界上種植大豆最主要的國家，有十分悠久的歷史。大豆豆渣是豆腐、豆漿及豆制品加工的副產物，約占大豆干重的15%～20%［1］。豆渣富含蛋白質、膳食纖維、脂肪、維生素及黃酮等物質，在癌癥預防、心血管疾病、肥胖控制及食品行業有廣泛的應用［2］。但由于豆渣含水量高、口感粗糙，同時含有抗胰蛋白酶、皂素等抗營養因子，不易被人體消化吸收和具有豆腥味等不利因素，其多被用作飼料，甚至廢棄物丟棄，造成環境污染及資源浪費［3－5］。研究表明，相對分子質量低于1 000的小肽極易被機體吸收，且具有較強的生物活性和功能特性，因此，如何利用豆渣獲得高水解度、高得率的小肽值得深入探討［6－7］。酶解蛋白不僅能生成抗氧化活性增強的小肽，且有助于改善該蛋白的溶解性、起泡性、低致敏性、高穩定性及乳化性等［8－10］。朱淑云等［11］和蘆鑫等［12］分別對酶解水飛薊粕和花生餅粕制備抗氧化肽進行了研究，為其加工利用擴開了新的途徑。本試驗對酶解豆渣蛋白肽的工藝進行研究，以對DPPH自由基清除率為考察指標，采用正交試驗確定酶解最佳工藝;探討其對·OH、O·－2的清除率、總還原力及其溫度、酸堿穩定性。將豆渣蛋白制成高附加值的具有抗氧化作用的肽，有助于擴大豆渣用途，為豆制品加工企業創收提供技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.5 MG AS1.398 中性蛋白酶、Flavorzyme風味蛋白酶及Alcalase FG 2.4 L堿性蛋白酶:諾維信;胰蛋白酶、DPPH自由基:sigma;抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris):生工生物工程有限股份有限公司;三氯乙酸－硫代巴比妥酸－鹽酸(TCA－TBA－HCl):15 g TCA，0.375 g TBA，2.1 mL HCl依次溶于 100 mL水中，超聲處理1 h。

1.2 儀器

TGL－20M型高速臺式冷凍離心機:湖南湘儀離心機儀器有限公司;PHS－3D雷磁pH計:上海精密科學有限公司;722型可見分光光度計:上海欣茂有限公司;UV－9600紫外分光光度計:北京瑞利分析儀器有限公司。

1.3 蛋白酶的初篩與復篩

1.3.1 蛋白酶活性測定及酪氨酸標準曲線的制作

參考 SB/T 10317—1999及福林 － 酚法［13］測定蛋白酶活性。酶活定義為1 g固體或1 mL液體蛋白酶，在一定溫度和pH條件下，1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1個活力單位，以U/g(U/mL)表示。1 mL蛋白酶在各最適溫度下預熱5 min，加入終濃度均為5 mg/mL豆渣蛋白，反應10 min，加入2 mL 0.4 mol/L TCA終止反應，3 500 r/min離心10 min，取上清液 1 mL，加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5 mL，福林試劑1 mL，40℃顯色20 min，660 nm測光吸收值。同時制作酪氨酸標準曲線，Y=0.010 2X+0.021 7，R2=0.998 2，式中:X 為酪氨酸質量濃度/μg/mL，Y為OD660。

1.3.2 豆渣蛋白的制備及其酶解

［14－15］。豆渣粉碎過80目篩，取篩下物按1∶12(m/V)加入0.1 mol/L NaOH溶液，充分攪拌浸提2 h，5 000 r/min離心15 min，殘渣重復浸提1次，合并2次上清液，5 000 r/min離心15 min，上清液調pH 5.4，4℃靜止2 h，傾去上清液，10 000 r/min離心10 min，沉淀用蒸餾水洗滌2次，離心收集沉淀，室溫干燥，即為豆渣粗蛋白。豆渣粗蛋白得率=豆渣粗蛋白(g)/豆渣(g)×100%，豆渣粗蛋白平均得率為33.17%。20 mg/mL豆渣蛋白溶于0.1 mol/L NaOH，3 500 r/min離心5 min，取上清液5 mL，磷酸緩沖液補至 15 mL，調 pH=7.0，終體積為20 mL，加入100 U中性蛋白酶，搖勻，60℃水浴，TCA終止反應，3 000 r/min離心10 min，上清液即為豆渣蛋白肽。

1.3.3 蛋白酶的初篩

相同豆渣蛋白濃度、酶活、酶解時間及各酶最適溫度和最適pH下保溫一定時間，滅活終止反應，取上清液稀釋一定倍數，測定對DPPH自由基清除率。

1.3.4 蛋白酶作用條件的復篩

初篩的蛋白酶通過單因素和正交試驗，確定最適酶解條件。單因素試驗:分別在不同酶量、溫度、豆渣蛋白濃度及pH條件下進行對DPPH·清除率的測定。正交試驗:以酶量、溫度、豆渣蛋白濃度及pH進行L9(34)正交試驗，見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.4 抗氧化試驗

1.4.1 對DPPH自由基的清除

取0.2 mL蛋白肽于試管中，用水補至2 mL，混勻，加入2 mL 0.04 g/L DPPH·無水乙醇溶液，混勻，室溫暗處反應20 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在 517 nm 處測光吸收值［16］，Ai;另取 0.2 mL蛋白肽于試管中，用水補充至2 mL，混勻，加入無水乙醇2 mL，室溫暗處反應20 min，取上清液測光吸收值，Aj;以2 mL 0.04 g/L DPPH·無水乙醇和2 mL無水乙醇為參比，測定光吸收值，A0。對DPPH·的清除率K/%=［1－(Ai－Aj)/A0］×100%。VC同法操作。

1.4.2 對·OH清除率的測定

參考牛慧慧等［17］和曾卓等［18］方法稍作修改。取1 mL 5 mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液于試管中，依次加入2 mL pH 7.4 0.2 mol/L磷酸緩沖液和1 mL樣品溶劑，混勻，加入1 mL 5 mmol/L硫酸亞鐵，混勻后加入1 mL 0.1%雙氧水，37℃水浴60 min，536 nm測定光吸收值，A損。未損傷管以1 mL蒸餾水代替損傷管中1 mL 0.1%雙氧水，樣品管以1 mL蛋白肽代替損傷管中的1 mL樣品溶劑，其他同損傷管，測得未損傷管的吸光度(A未)及樣品管的吸光度(A樣)，按下式計算·OH清除率:·OH清除率/%=(A樣－A損)/(A未－A損)×100%。VC同法操作。

1.4.3 對 O·－2清除率的測定

參考勵建榮等［19］方法并修改。0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL 蛋白肽于試管中，用 0.1 mmol/L pH 8.2 Tris－ HCl緩沖液補至 2.8 mL，加入 0.1 mL 0.018 mmol/L鄰苯三酚，迅速混勻并開始計時，每隔30 s測定 A320，共2 min。以0.1 mL 蒸餾水和2.8 mL 0.1 mmol/L pH 8.2 Tris－ HCl緩沖液為對照。VC同法操作。擬合光吸收值隨時間變化回歸方程，斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，清除率K/%=(v對照－v樣品)/v對照×100%。式中:v對照(ΔA對/Δt)為對照組鄰苯三酚自氧化速率(ΔA320/min);v樣品(ΔA樣/t)為加入蛋白肽后鄰苯三酚自氧化速率(ΔA320/min)。

1.4.4 總還原力的測定

參考賈俊強等［20］方法。分別取 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL 0.2 mg/mL 蛋白肽于試管中，用0.2 mol/LpH 6.6 磷酸緩沖液補至 1 mL，加入 0.75 mL 1%鐵氰化鉀，混勻后50℃水浴20 min，2 mL 10%TCA終止反應，3 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入 0.5 mL 0.1%FeCl3混勻，700 nm 測定光吸收值。VC同法操作。

1.4.5 脂質過氧化抑制作用

0.05、0.1、0.15、0.2 和 0.25 mL 5 mg/mL 蛋白肽于試管中，400 μmol/L FeSO41.0 mL，蛋黃 1.0 mL，pH 7.4 0.1 mol/L 磷酸緩沖液補至相同體積，混勻，避光，37℃水浴60 min。加入2 mL TCA－TBAHCl，100 ℃水浴15 min，迅速冷卻，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，532 nm測定光吸收值，A1。以相同體積磷酸緩沖液代替蛋白肽為對照，A0，抑制率I/%=(A0－A1)/A0×100。VC同法操作。

1.5 豆渣蛋白肽的特性

1.5.1 豆渣蛋白肽提取率的測定

利用李雪等［21］方法稍作修改。用0.1 mol/L HCl和NaOH調0.05 mg/mL蛋白肽pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 和 12.0，攪拌混勻30 min，7 500 r/min離心15 min，測定上清液蛋白含量。將豆渣蛋白溶于0.5 mol/L NaOH溶液中，測定總蛋白含量。豆渣蛋白提取率=上清液中蛋白總量(g)/豆渣中粗蛋白總量(g)×100%。蛋白含量測定采用雙縮脲法［22］。豆渣蛋白平均提取率為45.12%。

1.5.2 等電點的測定

利用楊立等［23］方法稍作修改。0.05 mg/mL蛋白肽分別以0.1 mol/LHCl和 NaOH調 pH，660 nm測定透光率，作pH值和透光率曲線，透光率最小時對應的pH值為肽等電點。

1.5.3 不同溫度下保溫時間對清除·OH能力的影響

0.05 mg/mL 蛋白肽，分別在60、70、80、90 ℃條件下水浴加熱30、60、90、120、150 min，測定清除·OH 能力。

1.5.4 不同時間下pH對清除·OH能力的影響

0.05 mg/mL 蛋白肽，用 1 mol/L HCl和 NaOH調 pH，使分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 及 11.0，30、60、90、120 min 后調 pH 值至7.0，測清除·OH 能力。

1.6 統計分析

所有試驗數據均平行3次，以平均值±標準差±s)表示，用Excel 2003進行單因素方差分析(P＜0.05)，用 origin7.5 作圖，spss16 進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

蛋白酶來源不同，對同一種蛋白質的水解作用存在差異，水解產物中肽的長度和結構也不同，因此酶的種類對酶解產物的抗氧化性有較大影響［24］。各蛋白酶作用條件見表2，結果見圖1，在30～250 min內，堿性蛋白酶(P ＜0.01)、胰蛋白酶(P ＜0.01)、風味蛋白酶(P＜0.01)及中性蛋白酶(P＜0.01)酶解產物對DPPH·清除率隨時間變化均顯著。各酶解產物對DPPH·清除率在120 min內均出現了較大波動，無規律可循，這表明酶與底物混合后生成蛋白肽的降解反應仍處于相對不穩定狀態。180 min時，中性蛋白酶清除率最大，隨后，清除率開始下降，這是因為酶解產物的抗氧化活性與特定時間內水解產生的活性片段的多少、長度及序列等有關［25］，隨時間的延長，活性多肽可能進一步被水解成無活性的小肽。綜合考慮酶解時間及清除率等因素，確定中性蛋白酶為最佳水解酶，酶解時間為180 min。

表2 蛋白酶的作用條件及酶活

圖1 蛋白酶的篩選

2.2 單因素試驗

豆渣蛋白濃度對DPPH·清除率的影響見圖2a(P ＜0.01)，在 3.5～4.5 mg/mL 范圍內，蛋白肽對DPPH·清除率隨其濃度增加而增大，隨后繼續增加濃度，清除率下降，這是因為在底物濃度較低時，其濃度增加可增大與酶的接觸機會，使平衡向產物方向進行，但當酶被底物飽和時，體系流動性差，反而不利于酶與底物的接觸［26－27］，因此水解速率下降，故豆渣蛋白質量濃度選擇 4.5 mg/mL。pH對DPPH·清除率的影響見圖2b(P＜0.01)。pH影響中性蛋白酶活性部位和豆渣蛋白的解離，從而影響產物的氨基酸組成，最終影響其對DPPH·的清除率。中性蛋白酶推薦的最適pH=7，故選擇6.5、7、7.5、8、8.5 對豆渣蛋白進行水解，在 pH 6.5 ～7 范圍內，清除率逐漸增加，pH 7.5時清除率最低，當pH＞8時，清除率開始下降，這是由于pH升高使中性蛋白酶活性減弱，因而酶解不完全，對DPPH·清除率降低，因此選擇pH=7。溫度對DPPH·清除率的影響見圖2c(P＜0.01)，中性蛋白酶推薦的最適溫度為60 ℃，因此選擇50、55、60、65、70 ℃對豆渣蛋白進行水解，在50～65℃范圍內，隨溫度的升高，清除率逐漸增加，65℃時清除率最大，比推薦值高5℃，說明抗氧化肽的分子可能較大，需要增溫進一步降解［28］。隨后清除率下降，原因是酶分子吸收過多能量，引起維持酶分子空間結構的次級鍵解體，中性蛋白酶熱變性失活，催化能力降低［29］，因此選擇65℃。酶量對DPPH·清除率的影響見圖2d(P＜0.01)，在50～100 U范圍內，清除率隨酶量的增加而增大，隨后繼續增加酶量，清除率先降低又增大，出現波動，這是因為當底物過量時，反應速度與酶量成正比，酶量繼續增大時，所有底物與酶結合，達到最大水解;另一方面生成的豆渣蛋白肽也會被酶再次降解，因此酶量選擇100 U。

圖2 單因素試驗

2.3 正交試驗

極差和方差分析見表3和表4。pH、酶量及溫度對DPPH·清除率影響均極顯著(P＜0.01)，蛋白肽濃度對DPPH·清除率影響不顯著(P＞0.05)。各因素對該酶解工藝的影響依次為D＞B＞A＞C，即酶量＞溫度＞pH＞蛋白肽濃度。最佳酶解工藝為A2B3C1D2，即pH=7，溫度70℃，蛋白肽濃度4 mg/mL及酶量100 U，正交試驗中第6組即為該組合。

表3 正交設計結果表

表4 方差分析

2.4 抗氧化性試驗

VC及豆渣蛋白肽對·OH清除見圖3a，對試驗數據進行擬合，回歸方程分別為Y=－2 461.3X2+1 531.5X －191.57，R2=0.999，Y= － 6 205.6X2+1 578.6X －9.413，R2=0.993。VC(P ＜ 0.05)及豆渣蛋白肽(P＜0.05)對·OH均表現出較強的清除作用，且隨其濃度的增大，清除作用呈增大趨勢，具有二次方量效關系［30］。VC及豆渣蛋白肽IC50分別為0.274和0.046mg/mL，說明豆渣蛋白肽對·OH清除能力強于VC。VC(P＜0.01)及豆渣蛋白肽(P＜0.01)對 O·2－的清除作用見圖3b，方程:Y=－29 428X2+4 110.5X － 38.003，R2=0.963，Y= － 320.01X2+297.14X+27.247，R2=0.898。VC 及豆渣蛋白肽 IC50分別為0.026 和0.084 mg/mL，說明豆渣蛋白肽對 O·2－清除能力弱于VC。VC(P＞0.05)及豆渣蛋白肽(P＞0.05)總還原力見圖3c。抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子或氫原子，與自由基形成穩定的產物，從而終止鏈式反應，因此還原能力越強，抗氧化作用越強［31］。方程分別為 Y= －3.9 021X2+15.468X+0.01，R2=0.9 97，Y= － 0.005X2+0.156X －0.001，R2=0.998，說明 VC 及豆渣蛋白肽的總還原力均與其濃度成正比，但后者弱于前者。VC(P＜0.01)及豆渣蛋白肽(P ＜0.01)對脂質過氧化的抑制見圖3d，后者弱于前者，VC(0.018～0.259 μg/mL)對脂質過氧化抑制能力先增大后減小，豆渣蛋白肽(0.167～0.333 mg/mL)基本保持不變，這可能是高濃度VC將Fe3+還原為Fe2+時產生了自由基，對脂質體氧化起到了促進作用［32］，對豆渣蛋白肽而言，可能是其具有較強的螯合能力，能與脂質過氧化所必須的Fe2+離子螯合，從而抑制卵黃脂蛋白過氧化反應的發生［33］;同時豆渣蛋白肽濃度已達較高水平，因此清除接近最大。

圖3 抗氧化試驗

2.5 豆渣蛋白肽的特性

不同溫度下豆渣蛋白肽對·OH清除率的影響見圖4a，當溫度高于80℃時，產物對羥自由基的清除率出現下降趨勢，這是由于溫度升高時，豆渣蛋白肽穩定性降低。豆渣蛋白肽等電點見圖4b(P＜0.01)，pH 3 時，透光率最低，即等電點約為 3，原因是等電點附近蛋白質處于兼性離子狀態，總電荷為零，缺乏靜電排斥作用，蛋白質分子易聚集、沉淀、因此溶解度最小［34］，pH 3～11范圍內，透光率增強。由于在酸度條件下才會析出，而一般食品及飲料行業pH均會遠離其等電點［23］，因此可廣泛應用于食品行業中。pH對豆渣蛋白肽提取率的影響見圖4c(P＜0.01)。高電荷、低疏水性可提高提取率。酶解可提高電荷數目，疏水性逐漸暴露，但前者作用大于后者，因此，整體上增加了豆渣蛋白肽的提取率［35－36］。在 pH 3～12 范圍內，豆渣蛋白肽提取率逐步增加，這是因為多肽鏈斷裂并暴露出離子化的氨基和羧基，使分子極性增強，親水性增加;同時破壞了分子中的疏水作用，使分子間相互排斥作用增加，提高了酶解產物的分散穩定性，進而提高了其提取效果［37－38］。不同時間下pH對·OH清除率的影響見圖4d，pH 2～4時，不同時間下產物對·OH清除率均出現下降趨勢，這是因為豆渣蛋白肽等電點在pH 3左右，其提取率降低，因此清除率下降，在pH 4～6范圍內，不同時間下產物清除率的增加是由于豆渣蛋白肽偏離等電點，電荷增加所致。pH＞6.5時，清除率下降，說明堿性條件不利于豆渣蛋白肽活性的穩定。

圖4 豆渣蛋白肽的特性

3 討論與結論

中性蛋白酶為豆渣蛋白肽最佳水解酶，其工藝為:pH 7，溫度70℃，蛋白肽濃度4 mg/mL及酶量100 U。VC(0.183～0.29 mg/mL)和豆渣蛋白肽(0.011～0.105 mg/mL)對·OH 具有清除作用，且隨濃度增大而增強;VC(0.017～0.088 mg/mL)和豆渣蛋白肽(0.086～0.431 mg/mL)對O·－2具有清除能力。研究表明，肽類清除O·－2能力差于·OH［39］，這是因為后者的氧化性強于前者，本試驗結果也體現了這一點。VC(0.004～0.032 mg/mL)和豆渣蛋白肽(0.092～1.472 mg/mL)的總還原力均與濃度呈正相關性［40］;VC(0.018 ～0.259 μg/mL)對脂質過氧化抑制能力先增大后減小，豆渣蛋白肽(0.167～0.333 mg/mL)基本保持不變。與VC相比較，豆渣蛋白肽的部分抗氧化指標相對較低，可能是酶解產物成分較為復雜，且為初級提純產品。豆渣蛋白肽等電點約為3.0，在pH 3～12范圍內，其提取率逐步增加。

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