三七渣發酵生產蛋白飼料的菌體生長動力學

譚顯東 胡 偉 段婭寧 王君君 羊依金

(成都信息工程學院資源環境學院，成都 610225)

通過固態發酵技術將中藥渣轉變為蛋白飼料，可以實現中藥渣的完全利用，這為中藥渣的資源化開辟了一條新的道路［1］。由于進行固態發酵過程參數的測量十分困難，已有的研究工作主要圍繞各種藥渣發酵工藝條件的優化展開［2～6］，對相關體系發酵動力學的研究少見報道。而發酵動力學是生化反應工程的基礎內容之一，以研究發酵過程的反應速率和環境因素對速率的影響為主要內容。通過發酵動力學的研究，可進一步了解微生物的生理特征，菌體生長和產物形成的合適條件，以及各種發酵參數之間的關系。固態發酵過程數學模型既可以用于指導生物反應器的放大設計，也可以用于對整個發酵過程的調控，是發酵過程優化研究的核心內容。

微生物是發酵培養過程的主體，固態發酵過程數學模型的開發依賴于微生物生長動力學過程的準確模擬，也直接影響著對固態發酵過程的精確調控。因此，開展了三七渣固態發酵生產蛋白飼料的菌體生長動力學研究。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

產朊假絲酵母(Candida utilis 2.281):四川大學建筑與環境學院;黑曲霉(Aspergillus niger sp.):山東農業大學生命科學學院;三七渣(其中粗蛋白、淀粉、真蛋白的質量分數分別為12.28%、33.13%、9.97%):四川省某中成藥廠;葡萄糖、硫酸銨、乙酸、乙酸鈉、乙醇、瓊脂:成都市科龍化工試劑廠。

QYC－211型恒溫振蕩器:上海福瑪實驗設備有限公司;PYX－280M－C型電熱恒溫培養箱:廣東韶關科力實驗儀器有限公司;SAL－T11型Labswiftaw便攜式水分活度測定儀:瑞士NOVASINA公司;UV－2550型紫外可見光光度計:SHIMADZU公司;KDN－08C型定氮儀:上海華睿儀器有限公司;7200型分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 培養基

PDA培養基:馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，pH 自然，121 ℃ 滅菌 20 min，用于黑曲霉的培養。

土豆汁液體培養基:馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH 自然，121 ℃滅菌 20 min，用于產朊假絲酵母的培養。

固態發酵培養基:在10.0 g經過預處理的三七渣中加入0.50 g硫酸銨，培養基含水量70%。于121℃滅菌30 min，用于菌體生長動力學試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 三七渣的預處理

三七渣濕物料經自然晾曬風干后于60℃干燥72 h、粉碎、過60目篩后置于干燥器中備用。

1.3.2 種子液的制備

黑曲霉采用PDA平板培養基在30℃下于電熱恒溫培養箱內培養3.5 d后刮下，將其制成濃度為2×107個/mL的孢子懸液;產朊假絲酵母采用土豆汁液體培養基在30℃下于電熱恒溫培養箱內培養18 h，制成濃度為2×107個/mL的菌懸液。

1.3.3 菌體生長動力學試驗

取126個容量為250 mL的錐形瓶，每個錐形瓶中裝入含10.0 g干三七渣的固態發酵培養基，將其在121℃滅菌30 min，冷卻后同步接入1.0 mL黑曲霉孢子懸液和1.0 mL產朊假絲酵母菌懸液，然后在30℃條件下進行恒溫培養，培養時間為10 d。試驗開始后，每隔12 h(含0時刻)取出6個錐形瓶進行相關參數的分析測試:從其中3個錐形瓶中分別取出1.00 g發酵培養物濕物料作為平行樣用于酶活的測試，然后將這3個錐形品中剩余的發酵培養物在80℃條件下烘干至恒重后作為平行樣用于提取核酸，并測試核酸提取液的吸光度;另外3個錐形瓶中的發酵培養物在80℃條件下烘干至恒重進行稱量。

所有試驗數據均為3個平行樣的平均值。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 真蛋白的測定

發酵培養物需要在80℃條件下烘48 h，再磨碎后取樣，然后先將樣品進行醇洗預處理去除其中的無機氮［7］，再采用凱氏定氮法測定［8］。

1.3.4.2 粗酶液的提取及酶活的測定

準確稱取1.00 g發酵培養物(濕基)，將其溶于pH=4.6的50 mL 0.2 mol/L乙酸－乙酸鈉緩沖液中，在40℃恒溫空氣浴中振蕩浸提1 h，然后經4層紗布過濾后，將濾液在5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液制成粗酶液，置于冰箱中待用。

FPA酶活參照文獻［9］、淀粉酶活參照文獻［10］提供的方法進行測定。

1.3.4.3 水分活度測定

采用Labswift－aw便攜式水分活度測定儀。

1.3.4.4 水分含量測定

將發酵后的培養物連同錐形瓶一起稱重，減去錐形瓶自身的質量后可得到發酵培養物的濕重W1，再將發酵后的培養物連同錐形瓶一起放入80℃的烘箱中烘干至恒重，將其置于干燥器中冷卻至室溫后再稱重后可以計算得到發酵培養物的干重W2。水含量可以通過下列公式計算:

1.3.4.5 菌體的生長情況的測定

參照文獻［11］，通過測定發酵培養物核酸提取液在260 nm處的OD值來間接反映菌體的生長情況。

1.4 建立數學模型的方法

由于對數模型的數學表達形式相對簡單:只需要用一個方程就能夠近似表示包括適應期、對數生長期和穩定期在內的生長曲線，因此在固態發酵動力學研究中得到了廣泛的應用［12］。在本研究中采用絲狀真菌和酵母菌進行混菌發酵，由于菌絲體會滲透到固態基質之中，與基質緊密的纏結在一起，再加上微生物代謝分泌的各種水解酶類也是目標產物，因此很難進行菌體的直接測量。相關研究［13］發現發酵過程中干物質減重率和菌體細胞的濃度存在線性關系，這樣就可以用宏觀的干物質減重率來間接地描述菌體的生長，用于指導過程設計和放大［14－15］。干物質減重率X(%)定義如下:

式中:m0為t=0時發酵底物的干基質量/g;mt為t時刻發酵培養物的干基質量/g。

相應的菌體生長動力學方程數學表達式如下:積分后可得

式中:X為t時刻干物質減重率/%;Xm為最大干物質減重率/%;X0為t=0時干物質減重率/%;μ為比生長速率常數/h－1;t為發酵時間/h。

本次研究采用Origin 8.0軟件內置的Slogistic3標準曲線模型對發酵過程中X－t的關系進行非線性擬合，建立了菌體生長動力學模型。

2 結果與討論

2.1 三七渣發酵過程動態分析

2.1.1 真蛋白含量及產率系數的動態變化

發酵培養物真蛋白含量及產率系數的動態變化如圖1所示。

由圖1可以看出，發酵培養物的真蛋白含量隨發酵時間的延長不斷增長，達到峰值后，又逐漸下降，最后趨于穩定。在采用采用黑曲霉固態發酵米糠［16］、好食鏈孢霉(Neurospora sitophila)發酵麩皮［17］以及采用青霉(Penicillium)、根霉(Rhizopus)、木霉(Trichoderma spp.)發酵蔓越莓廢渣［18］的研究中發酵培養物中蛋白含量變化趨勢與本次研究相似。由圖1還可以看出，真蛋白產率系數(指投入單位質量的發酵底物經過一段時間的發酵后所能收獲的真蛋白質量)隨時間的變化趨勢則有所不同，在0～36 h期間，真蛋白產率系數逐漸增大，特別是在12～36 h期間，真蛋白產率系數的增加速度是整個發酵周期中最快的，這一階段對真蛋白凈增長貢獻最大;在隨后的108 h(第36～144 h)期間，真蛋白產率系數在0.132～0.138 g真蛋白/g干三七渣之間波動，基本維持穩定，這一階段對真蛋白凈增長幾乎沒有貢獻，但是在這一階段，微生物通過呼吸作用產生了“濃縮效應”，對發酵培養物真蛋白含量的提高起到了重要作用。在144～240 h期間，真蛋白產率系數不斷下降，特別是204 h以后，真蛋白產率系數在數值上已經低于發酵原料三七渣自身的真蛋白含量(0.099 7 g真蛋白/g干三七渣)。產生這種現象的原因在于:在總氮平衡的發酵體系中，分解作用會減少系統中蛋白質總量［19］，需要通過對發酵周期的選擇來控制這種負效應。

圖1 真蛋白含量和產率系數的動態變化

2.1.2 發酵培養物酶活的動態變化

發酵培養物FPA酶活和淀粉酶活的動態變化如圖2所示。

圖2 酶活的動態變化

由圖2可以看出，FPA酶活與淀粉酶活都先隨著發酵時間的延長逐漸增大，在發酵156 h后達到峰值，然后FPA酶活逐漸下降，淀粉酶活穩定了24 h后也開始下降。酶活力的大小反映了體系中酶蛋白濃度的高低和對相應底物的催化水解能力。本研究中酶活達到峰值的時間與發酵培養物中真蛋白含量以及生物量達到峰值的時間基本一致。在采用生木薯渣培育根霉時，發酵初期，α－淀粉酶活與葡萄糖淀粉酶活也都呈現不斷上升的趨勢［20］。采用黑曲霉發酵小麥麩皮、米糠、落花生草料以及鋸木屑時，CMC酶活在發酵24 h后達到最高，隨后逐漸下降;而FPA酶活卻在第3天才達到峰值，然后逐漸下降［16］。

2.1.3 干重的動態變化

發酵培養物干重的動態變化如圖3所示。

圖3 發酵培養物干重的動態變化

由圖3可以看出，發酵培養物干重隨著發酵時間的延長而逐漸降低，到發酵末期基本保持穩定。在發酵24～72 h期間，發酵培養物干重的降速最大，72～168 h期間降速有所減緩，168～240 h期間基本維持不變。在這3個階段，發酵培養物干重的變化速率分別為 1.41、0.525、2.36 ×10－3g/d，發酵結束時產品收率為50.5%。而在采用黑曲霉發酵蔬菜廢棄物9 d后，發酵培養物僅減重4%［21］。發酵培養物減重的速率和比例與基質中碳源是否容易被利用直接相關。

2.1.4 OD260的動態變化

參照文獻［11］所描述的方法提取發酵培養物中的核酸，將提取液稀釋5倍后測量其吸光度，間接表示發酵過程中菌體生長情況，結果如圖4所示。

由圖4可以看出，在0～132 h期間，OD260值逐漸增長;132～168 h期間，OD260值基本保持穩定;168 h后OD260值有所下降。這與微生物生長曲線的變化趨勢基本一致。在采用黑曲霉固態發酵長豆角莢［22］和小麥麩皮［23］，采用產朊假絲酵母發酵蘋果渣［24］和米糠［25］的研究中發現菌體生長的動態變化趨勢也與此相似。

圖4 OD260的動態變化

2.1.5 水含量和水活度的動態變化

發酵過程中水含量和水活度隨時間的變化如圖5所示。

圖5 水含量和水活度的動態變化

由圖5可以看出，在發酵12～84 h期間，水活度輕微下降，可能是由于在此期間微生物新陳代謝非常活躍，在短期內產生了大量的代謝熱，促進了水分的蒸發，使得體系的含鹽量相對增加所造成。由圖5還可以看出，在發酵過程中發酵培養物的水含量逐漸增加，這與采用黑曲霉發酵炒制過的木薯渣［26－28］和蔬菜廢棄物［29］時發酵培養物水含量的動態變化趨勢相似。但是，在黑曲霉固態發酵小麥麩皮［23］過程中卻發現培養物水含量沒有顯著變化。固態發酵過程中發酵培養物水含量的變化應歸因于菌體生長、孢子形成和萌發、產物形成、蒸發作用對水的消耗和生成作用［29］。由于影響因素復雜，所以在不同發酵體系中往往呈現出不同的結果。

2.2 菌體生長動力學模型

發酵培養物的干物質減重率隨時間的動態變化如圖6所示。采用Origin8.0軟件按照式(2)所示的對數模型對圖6中的數據進行非線性擬合，擬合曲線和相關統計參數分別見圖6和表1。

圖6 菌體生長擬合曲線

表1 菌體生長動力學模型參數表

由圖6和表1可以看出，擬合曲線的相關性很好，符合統計檢驗的要求。根據上述結果，可以得到黑曲霉/產朊假絲酵母固態發酵三七渣生產蛋白飼料過程中的菌體生長動力學方程如下:

或

利用Origin8.0軟件對圖4中的擬合曲線進行數值微分，可以獲得菌體生長速率隨時間變化的曲線，結果如圖7所示。

圖7 菌體生長速率的動態變化

由圖7可知，在發酵66 h后菌體生長速率達到最大值。

3 結論

3.1 發酵培養物真蛋白含量、酶活、核酸提取液OD260的變化趨勢基本一致:它們先隨發酵時間的延長而逐漸增大，然后又逐漸降低并趨于穩定;發酵培養物水含量變化較大，而水活度變化較小。

3.2 以干物質減重率作為表達菌體濃度的間接參數，菌體生長動力學適合采用對數模型進行描述，最大干物質減重率為52.22%，比生長速率常數μ=0.041 31 h－1。菌體生長速率在發酵66 h后達到最大值。

［1］譚顯東，王向東，黃健盛，等.中藥渣資源化技術研究進展［J］.中成藥，2010，32(5):847 －849

［2］譚顯東，王向東，楊平，等.康寧木酶固態發酵中藥渣制備蛋白飼料［J］.四川大學學報:工程科學版，2008(4):71－76

［3］劉鳳梅，譚顯東，羊依金，等.三七渣固態發酵生產蛋白飼料［J］.中國釀造，2011(2):67－70

［4］秦嶺，王向東，潘朝智，等.多菌種混合發酵生脈飲藥渣生產蛋白飼料工藝條件優化［J］.食品與生物技術學報，2008(4):122－128

［5］王兵，王向東，秦嶺，等.中藥渣固態發酵生產蛋白飼料［J］.食品與生物技術學報，2007(4):77－82

［6］段婭寧，譚顯東，羊依金，等.用于蛋白富集的三七渣培養基制備條件優化［J］.中國飼料，2012(7):40－42

［7］胡艷麗，王克然.飼料中真蛋白的測定［J］.河南畜牧獸醫，2007，28(10):31 －32

［8］張麗英.飼料分析及飼料質量檢測技術［M］.北京:中國農業大學出版社，2007:52－61

［9］陳洪章.纖維素生物技術［M］.北京:化學工業出版社，2011:261－265

［10］陳毓荃.生物化學實驗方法和技術［M］.北京:科學出版社，2002:83－86

［11］魏培蓮，岑沛霖，盛春琦.3種固態發酵生物量測定方法的比較［J］.食品與生物技術學報，2006，25(1):60 －64，69

［12］Mitchell D A，Vonm O F，Krieger N，et al.A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and intraparticle phenomena in solid － state fermentation［J］.Biochemical Engineering Journal，2004，17:15 －26

［13］Mitchell D A，Greenfield P F，Doelle H W.An empirical model of growth of Rhizopus oligosporus in solid－state fermentation［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1991，72:224 －226

［14］Wang R，Shalyda M D，Godoya L C，et al.Bioconversion of rapeseed meal for the production of a generic microbial feedstock［J］.Enzyme and Microbial Technology，2010，47:77 －83

［15］Weng X Y，Sun J Y.Kinetics of biodegradation of free gossypol by Candida tropicalis in solid － state fermentation［J］.Biochemical Engineering Journal，2006，32(3):226 －232

［16］Chandra M S，Viswanath B，Reddy B R.Cellulolytic enzymes on lignocellulosic substrates in solid state fermentation by Aspergillus niger［J］.Indian Journal of Microbiology，2007，47(10):323－328

［17］Shojaosadati S A，Faraidouni R，Madadi－ Nouei A，et al.Protein enrichment of lignocellulosic substrates by solid state fermentation using Neurospora sitophila［J］.Resources，Conservation and Recycling，1999，27:73 － 87

［18］Zheng Z X，Shetty K.Cranberry processing waste for solid state fungal inoculant production［J］.Process Biochemistry，1998，33(3):323 －329

［19］白玉明，褚西寧，張紅，等.單細胞蛋白固態發酵系統的總氮平衡與功效評價［J］.山西大學學報:自然科學版，1998，21(1):72 －76

［20］Soccol C R，Marin B，Raimbault M，et al.Breeding and growth of Rhizopus in raw cassava by solid state fermentation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1994，41:330－336

［21］Rajesh N，Joseph I，Paul Raj R.Value addition of vegetable wastes by solid－state fermentation using Aspergillus niger for use in aquafeed industry［J］.Waste Management，2010，30(11):2223－2227

［22］Smail T，Salhi O，Knapp J S.Solid － state fermentation of carob pods by Aspergillus niger for protein production:effect of particle size［J］.World Journal of Microbiology ＆ Biotechnology，1995，11:171 －173

［23］Hamidi－ Esfahani Z，Shojaosadati S A，Rinzema A.Modelling of simultaneous effect of moisture and temperature on A.niger growth in solid － state fermentation［J］.Biochemical Engineering Journal，2004，21:265 －272

［25］Rajoka M I，Tariq Kiani M A，Khan S，et al.Production of single cell Protein from rice Polishing using Candida utilis［J］.World Journal of Microbiology ＆ Biotechoology，2004，20(3):297－301

［26］Oriol E，Raimbault M，Roussos S，et al.Water and water activity in the solid state fermentation of cassava starch by Aspergillus niger［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1988，27:498－503

［27］Narahara H，Koyama Y，Yoshida T，et al.Growth and enzyme production in a solid－state culture of Aspergillus oryzae［J］.J Ferment Technol，1982，69:311 －319

［28］Oriol E，Schettino B，Viniegra － Gonzales G，et al.Solid －state culture of Aspergillus niger on support［J］.Journal ofFermentation Technology，1988，66(1):57 －62

［29］Foong C W，Janaun J，Krishnaiah K，et al.Effect of superficial air velocity on solid state fermentation of palm kernel cake in a lab scale fermenter using locally isolated fungal strain［J］.Industrial Crops and Products，2009，30:114 －118.