異味物質β-環檸檬醛降解菌的分離和鑒定

代志剛 蔣永光 谷依露 胡晗華 李仁輝

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異味物質β-環檸檬醛降解菌的分離和鑒定

代志剛1, 2蔣永光1, 2谷依露1, 2胡晗華1李仁輝1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

β-環檸檬醛(β-cyclocitral)是由微囊藻產生的主要藻源性異味污染物之一。利用稀釋涂平板法, 從采集到的微囊藻水華水樣中分離得到兩株降解β-環檸檬醛的菌株DH16和DH18, 16S rRNA序列比對和系統進化樹分析表明它們分別屬于食酸菌屬 ()和不動桿菌屬()。實驗室保藏的微囊藻毒素降解菌sp. THN1對β-環檸檬醛也有降解效果, 該菌屬于新鞘氨醇桿菌屬()。對三株菌進行以β-環檸檬醛為唯一碳源的培養實驗, 氣相色譜檢測分析表明DH18和THN1兩株菌具有高效降解β-環檸檬醛的能力, 可以作為研究β-環檸檬醛生物降解機理的理想材料。

微囊藻; β-環檸檬醛; 食酸菌屬; 不動桿菌屬; 新鞘氨醇桿菌屬; 生物降解

水體富營養化引起的藍藻水華的大規模暴發, 不僅消耗了水體中的溶解氧, 導致水體生態平衡的破壞, 而且還產生了大量具有異味的次生代謝產物, 引發了嚴重的水體異味污染。目前研究較多的藻源性異味污染物質主要分為兩類: 一類是以土腥素(Geosmin)和二甲基異莰醇(2-MIB)為代表的土霉異味[1, 2]; 另一類是以β-環檸檬醛(β-cyclocitral)和β-紫羅蘭酮(β-Ionone)為代表的草木味[3]。

根據現有的報道, β-環檸檬醛主要由微囊藻產生, 并且是其主要的揮發性代謝產物[4, 5]。β-環檸檬醛在不同質量濃度下(0.5—80 μg/L)分別為青草味、甘草味、木頭味和煙草味[6, 7], 通常在淺水富營養化湖泊中有較高的濃度, 并與微囊藻細胞的數量呈現出良好的相關性[8]。由于往往伴隨微囊藻水華的發生而大量產生, 嚴重影響了水體的水質狀況[9]。

國內外傳統的處理飲用水嗅味的方法主要包括活性炭吸附[10]、光起始氧化法[11]、臭氧和高錳酸鉀氧化法[12, 13]等。這些方法的成本較高, 處理效率也并不理想。生物降解法是通過添加有降解效果的微生物來去除嗅味物質。與傳統方法相比, 生物降解法經濟、高效、無二次污染, 為水處理提供了新的思路和手段。目前已有多篇關于微生物降解水體異味物質2-MIB和Geosmin的報道[14—16]。

國內外對藍藻中β-環檸檬醛的研究主要是通過對水樣的監測和調查來獲得水體中異味物質的濃度[17], 關于β-環檸檬醛的生物降解、去除的效果和影響因素還沒有報道。本研究從微囊藻水華暴發的湖泊中采集水樣, 分離和鑒定了兩株降解β-環檸檬醛的菌株DH16和DH18, 并驗證了一株已經報道的微囊藻毒素降解菌THN1對β-環檸檬醛的降解能力。通過對這三個菌株進行降解β-環檸檬醛的研究, 為進一步探究β-環檸檬醛的降解機理和建立生物降解β-環檸檬醛的有效方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

GC-2014C氣相色譜儀, FID 檢測器(SHIMADZU, 日本); 色譜柱為GL TCseriesWondaCap 5 (0.25 mm× 30 m×0.25 μm); 固相微萃取(SPME)裝置, 50/30 μm二乙烯基苯涂層纖維/活性炭/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS, 57328-U), 25 mL帶PTFE涂層硅橡膠墊的棕色螺口瓶均為Supelco (Sigma-Aldrich公司, 美國) 產品; 磁力攪拌器; 0.94 g/mL 的β-環檸檬醛標準品購買自美國SAFC公司; NaCl為分析純(上海國藥), 經550℃烘烤6h后保存于棕色玻璃試劑瓶中; pMD18-T載體(Takara, Japan); 感受態細胞DH5α (Takara, Japan); 凝膠試劑盒(BioFlux, Japan)。

1.2 頂空固相微萃取方法

在25 mL帶PTFE涂層硅橡膠墊的棕色螺口瓶中加入待測藻液與Millipore超純水共10 mL, 3 g NaCl和一個微型磁轉子(最后體系的pH要維持在8—10)。將螺口瓶置于60℃恒溫水浴中, 使用固相微萃取裝置將萃取纖維針頭刺穿硅橡膠墊插入瓶中。推出萃取纖維頭, 使其暴露于液面上的頂空環境中。頂空吸附45min后, 收回萃取纖維, 插入到氣相色譜進樣室中解吸附, 進行色譜分析[8, 18]。

1.3 氣相色譜(GC)分析條件

GC-FID的分析條件為: 載氣高純N2, 恒壓150 kPa; H2恒壓45 kPa; 空氣恒壓40 kPa; 進樣口溫度250℃, FID 檢測器溫度270℃; 進樣方式采用無分流進樣(splitless) 2min。GC-FID的分析程序: 初溫60℃, 保持2min, 以5℃/min的升溫速度升至200℃, 保持2min 后再以20℃/min的速度升至250℃并保持2min。

1.4 β-環檸檬醛降解菌的分離

分別采集微囊藻水華暴發的黑龍江大慶市的明湖和龍虎泡、無錫太湖和武漢東湖的表層水樣, 經孔徑為2 μm的微孔濾膜抽濾后取0.5 mL濾液分別稀釋10倍、100倍、1000倍, 均勻涂布于以β-環檸檬醛為唯一碳源(20 μg/mL)的固體無機鹽培養基M9平板上(無葡萄糖M9液體培養基中添加1.5%的瓊脂, 高溫滅菌溶解, 冷卻后加β-環檸檬醛), 置于30℃恒溫培養箱中進行選擇性培養。兩個星期長出單個菌落。用牙簽挑取單個的菌落劃線于新的LB固體平板上培養, 通過多次平板劃線對得到的菌落進行分離純化。

1.5 β-環檸檬醛降解菌的驗證

將純化后的菌落接種到LB液體培養基中培養過夜。離心收集菌體, 用無菌水洗滌, 除去LB。得到的菌種加入到含5 mL液體M9培養基(0.1% NH4Cl、0.05%NaCl、0.3% KH2NPO4、1.28% Na2PO4·7H2O、0.05% MgSO4·7H2O、0.0015% CaCl2·2H2O)的試管中,管口用封口膜密封于30℃下黑暗培養, 以不接入菌體但是含相同濃度的β-環檸檬醛(20 μg/mL)的培養基作為對照。7d后取培養物, 過膜除菌后, GC檢測濾液中β-環檸檬醛的含量。本實驗保藏的微囊藻毒素降解菌THN1按同樣方法進行實驗。

1.6 降解菌株對β-環檸檬醛降解能力的比較

選取其中有明顯降解效果的菌株, 用LB培養過夜。洗滌除去LB后, 用M9液體培養基稀釋, 確定菌液OD值(600 nm處)為0.1。以不加菌的空白作為對照, 分別加入β-環檸檬醛(終濃度20 μg/mL), 在30℃下進行培養, 在第2、第4、第6天分別對培養液進行GC檢測, 高效降解菌在第2天和第4天補加β-環檸檬醛至20 μg/mL, GC檢測β-環檸檬醛的含量的變化情況。

1.7 β-環檸檬醛降解菌的鑒定

選取具有明顯降解效果的菌株, 挑取單個菌落作為模板, 用細菌16S rRNA的通用引物27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R: 5'-GG CTACCTTGTTACGACTT-3', PCR擴增后切膠回收得到目的片段, 與pMD18-T載體連接, 轉化。挑取陽性的轉化子進行PCR檢測, 送測序。得到的序列與NCBI基因數據庫比對, 構建系統進化樹, 確定菌種所屬的種類。

2 結果

2.1 β-環檸檬醛降解菌的分離

水樣稀釋涂固體培養基平板培養兩個星期后, 部分平板上長出不同形態的菌落, 大部分為乳白色, 少許為黃色, 面積較小, 直徑在0.5—3.5 mm, 菌落表面突起, 邊緣光滑。

挑取單個菌落, 繼續劃線分離, 最終從東湖和太湖水樣中分離純化得到6個菌株, 分別編號為DH14、DH15、DH16、DH17、DH18、TH19。

2.2 β-環檸檬醛降解菌的驗證

以上6個菌株和THN1, 在液體M9培養基中以β-環檸檬醛為唯一碳源培養1個星期后, 與對照比較(圖1、圖2)。

與對照中β-環檸檬醛最后含量比較可以發現, DH16、DH18和THN1具有較強的降解能力, THN1的降解率接近100%。

2.3 降解菌對β-環檸檬醛降解能力的比較

選取菌株DH16、DH18和THN1分別接種到β-環檸檬醛初始濃度為20 μg/mL的M9培養基中培養, 以不加菌的培養基作為對照, 分別在第2、第4、第6天對培養物進行GC檢測。2d后發現菌株DH18和THN1培養物中β-環檸檬醛基本上被利用完全(圖3)。第2天和第4天后重新加入初始濃度的β-環檸檬醛, 繼續培養后β-環檸檬醛再次利用完全, DH16則不能完全降解β-環檸檬醛。

圖 1 一星期后對照液和不同菌株培養物中β-環檸檬醛的含量

圖2 一星期后對照液和不同菌株培養物中β-環檸檬醛氣相色譜分析圖

2.4 β-環檸檬醛降解菌的鑒定

將三株菌株的16S rRNA測序結果在NCBI上進行比對分析, 構建系統進化樹(圖4)。通過PCR擴增得到兩株菌DH16和DH18的16S rRNA基因序列, THN1的序列從GenBank中獲得, 序列號為HQ664117.1。將三個菌株的序列與GenBank中相似的菌株序列進行比對整理, 構建NJ樹。得到的結果顯示菌DH16屬于假單胞菌屬()中新分立出的食酸菌屬 (); 菌DH18屬于假單胞菌目(Pseudomonadales)中的不動桿菌屬()。

圖 3 菌DH18對β-環檸檬醛的降解

3 討論

目前, 隨著全球水體富營養化的加劇, 由藍藻引起的水華頻繁發生。藍藻的大量繁殖所代謝產生的次生代謝產物引起的水質污染特別是對飲用水源中污染成為一個嚴重且普遍存在的環境問題。微囊藻的次生代謝產物主要是對人類健康有害的微囊藻毒素和具有揮發性的異味物質β-環檸檬醛。目前對微囊藻有害代謝產物的研究主要集中在微囊藻毒素的研究上[19], 對異味物質β-環檸檬醛的研究相對較少, 但是隨著水質的日趨惡化, 由β-環檸檬醛引起的水體嗅味問題也越來越受到研究者的重視。

圖4 基于16SrRNA基因序列的NJ分子系統樹

生物降解法是目前新興的一種降解異味物質的方法。其特點就是利用微生物本身特異性的代謝途徑對異味物質進行降解和轉化, 達到完全除去的效果。由于微生物種類的多樣性以及其體積小、代謝速率快等特點, 生物降解法在未來的水體嗅味處理技術中具有更大的競爭力和潛力, 而且國內外已經有大量文獻報道關于對2-MIB和geosmin的生物降解研究, 積累了豐富的經驗, 也取得了比較滿意的結果。1996年, Tanaka,.[20]從污水處理廠的逆流水中分離出兩株能降解 2-MIB 的微生物, 分別屬于假單胞菌屬和腸桿菌屬, 并發現這兩株菌存在不同的降解途徑; Yagi,.[21]報道在生物活性碳濾池上發現了芽孢桿菌屬()能降解 mg/L 級的 2-MIB。Saadoun和 EI-Migdadl[22]進行了革蘭氏陰性菌降解Geosmin的研究; Hoefel,.[23]發現一種革蘭氏陰性細菌Geo48, 這種細菌可有效降解geosmin。但是目前國內對嗅味物質及其生物降解方法研究尚少, 周北海等[16]從水源水中分離到了降解2-MIB的假單胞菌屬(); 么敬靜等[24]從污水處理廠中分離到一株以 2-MIB為唯一碳源的陰溝腸桿菌()。而本實驗室王中杰對2-MIB和Geosmin的合成基因做了系統和詳細的研究[25], 并對其特征和分子起源與進化等方面進行了深入的報道。

本研究旨在研究關于生物降解由藍藻(微囊藻)產生的異味物質β-環檸檬醛, 從武漢東湖采集的水樣中成功分離純化得到兩株β-環檸檬醛降解菌DH16和DH18, 通過在液體培養基中的降解實驗, 證明兩株菌均具有較強的降解能力。與以往從活性炭和砂濾池的生物膜中篩選方法相比, 本實驗主要通過稀釋涂平板法來進行分離, 降低了實驗操作難度和分離周期, 而且直接從有微囊藻水華的湖泊中采集水樣進行處理, 具有更好的實效性。通過NCBI序列比對和構建系統進化樹分析, 確定了菌DH16屬于食酸菌屬 (), 而菌DH18屬于不動桿菌屬()。目前, 已有相關文獻報道不動桿菌屬()[26]可能具有2-MIB的生物降解能力。而另一株菌THN1為本實驗室從太湖分離的一株能降解微囊藻毒素的菌sp.THN1[27], 該菌既能有效降解β-環檸檬醛, 也能有效降解微囊藻毒素, 而兩者均為微囊藻產生的次生代謝產物, 這對于后續研究關于微囊藻次生代謝產物的生物降解提供了參考和原料。對三株菌做β-環檸檬醛的降解實驗, 在一定階段的時間范圍內重復加入β-環檸檬醛, DH18和THN1表現出高效降解β-環檸檬醛能力, 可以作為研究β-環檸檬醛生物降解機理的理想材料。

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Isolation and identification ofb-cyclocitral degrading bacteria

DAI Zhi-Gang1, 2, JIANG Yong-Guang1, 2, GU Yi-Lu1, 2, HU Han-Hua and LI Ren-Hui1

(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

β-cyclocitral, one of the most common taste and odour compounds, is mostly produced by water bloom forming. Using the agar-plate method, bacterial strains DH16 and DH18 for degrading β-cyclocitral were isolated from the water samples in thedominated water blooms. Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequences revealed that these strains belonged to generaandrespectively. The strains sp.THN1, a reported microcystin degraded strain, was also shown to have the ability to degrade β-cyclocitral. The experiment using β-cyclocitral as the sole carbon source demonstrated that strains DH18 and THN1were able to decompose β-cyclocitral efficiently, and these bacterial strains could provide good model organisms for the studying the biodegradation of β-cyclocitral.

; β-cyclocitral;;;s; Biodegradation

2012-12-25;

2013-11-17

國家“十二五”水專項(2012ZX07101-02-001-01)資助

代志剛(1988—), 男, 湖北荊門人; 碩士研究生; 主要從事有害藻類監測研究。E-mail: daizg0601@163.com

李仁輝(1965—), 研究員; 主要從事藍藻分類系統以及藻類環境生物學研究。E-mail: reli@ihb.ac.cn

X172

A

1000-3207(2014)02-0222-05

10.7541/2014.33