基于尼羅紅染色分析金藻總脂動態積累

周文俊 鄭 立 韓笑天 鄭明剛 張魁英 高 偉 崔志松

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基于尼羅紅染色分析金藻總脂動態積累

周文俊1鄭 立1韓笑天2鄭明剛1張魁英1高 偉1崔志松1

(1. 國家海洋局第一海洋研究所海洋生態研究中心, 青島 266061; 2. 中國科學院海洋研究所海洋環境科學重點實驗室, 青島 266060)

通過尼羅紅熒光染色對一株富油微藻金藻sp.CCMM5001建立和完善了一種方便快捷且能準確定量金藻油脂含量的方法, 利用該方法探索了不同培養條件對金藻生長和總脂積累的影響。結果表明: 經尼羅紅染色后, 金藻的單細胞熒光強度與其總脂含量呈良好的線性關系; 金藻最適生長的氮濃度、光照強度和溫度分別為1323 μmol/L、148.0 μmol/(m2·s)、25℃; 最適總脂積累的氮濃度、光照強度和溫度分別為441 μmol/L、92.5 μmol/(m2·s)、15℃; 優化培養條件并采用兩階段培養法后總脂含量和油脂產率都有大幅提高, 可分別高達63.3%和22 mg/(L·d)。

金藻; 尼羅紅; 總脂; 熒光強度; 生長曲線

近年來, 生物柴油因其來源廣泛、燃燒性能高、對環境污染低以及可再生等優點而成為研究熱點。目前國際上主要以大豆、油菜籽、蓖麻籽、棕櫚種子以及動物脂肪等為原料生產生物柴油[1—3], 但這些原料尚不能滿足當前經濟發展對生物柴油的需求, 同時因其與糧食作物爭用耕地而可能導致世界糧食供應問題[4], 對此, 科研人員提出用高油脂含量的微藻來替代傳統油料作物生產生物柴油[4—6]。以微藻為原料生產的生物柴油具有清潔環保、燃燒性能好以及可再生等優點, 一些微藻如[7]、sp.[8]、[9]、[10]和[11]等已被報道可以高效地生產優質的生物柴油。盡管如此, 這類適合應用于生產生物柴油的微藻種類還很有限, 而如何快速有效地從大量的微藻種類中篩選高油脂含量的藻種, 并根據其油脂積累特點優化培養條件以獲得最高的油脂產率一直是微藻生物柴油研究需要解決的難題。傳統的油脂提取方法要預先收集足量的藻體并進行凍干、研磨、反復萃取、離心以及旋轉蒸發等一系列繁瑣的步驟[12], 這不僅耗時耗力, 并且需要使用大量三氯甲烷和甲醇等化學試劑。因此, 亟待建立和完善一種方便快捷且能準確定量檢測微藻油脂含量的方法。

尼羅紅是一種具有較強熒光特性的疏水性染料,它可與脂類物質結合, 在特定波長的激發下發出強烈的橙黃色或紅色熒光, 但在水溶劑中, 其熒光性完全淬滅。目前, 尼羅紅已被廣泛應用于對哺乳動物細胞、浮游動物、酵母菌以及微藻等的油脂進行定性觀察和原位檢測[13—16]。研究發現, 激發波長和散射波長分別為450—500 nm和>528 nm時, 經尼羅紅染色的微藻細胞熒光強度(Fluorescence intensity, FI)與細胞內油脂(中性脂)含量顯著相關[17—19]。因此, 可通過即時測定熒光強度的大小來原位檢測微藻的油脂含量, 從而了解其油脂積累規律并確定最佳培養條件和收獲周期。與傳統的油脂含量測定方法相比, 尼羅紅法操作簡單, 所需微藻生物量小, 并且允許同時處理大批量的樣品。但研究也表明, 并非所有微藻都可被尼羅紅染色, 所以該方法只能針對合適的藻種開展油脂含量的測定研究。

經本實驗室前期的培育和研究發現, 實驗室篩選的一株金藻sp.CCMM5001細胞內含有豐富的油脂資源, 其總脂含量可高達藻細胞干重的40%, 且適合制備生物柴油的C14-C18系脂肪酸含量為總脂肪酸含量的80%以上, 表現出作為一種生產生物柴油候選藻種的優良特性, 但其油脂積累的動態規律及具有最高油脂產率的最佳培養條件還需進一步研究。值得一提的是該金藻無細胞壁, 極易被染色材料著色, 但利用尼羅紅對其進行染色所開展的油脂含量的測定研究還未見報道。

本文擬通過尼羅紅染色法建立一種方便快捷且能準確定量微藻油脂含量的方法, 并利用該方法探討不同氮濃度、光照強度和溫度培養條件下金藻的油脂動態積累過程, 從而確定其生產油脂的最佳培養條件, 為進一步對金藻進行大規模培養以生產優質的生物柴油奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 微藻來源及其培養

實驗藻株金藻sp.CCMM5001由中國科學院海洋研究所提供, 培養使用f/2培養液配方[20], 光照強度92.5 μmol/(m2·s), 光暗比16h︰8h, 溫度(25±1)℃。

1.2 儀器與試劑

多功能酶標儀(Tecan Infinite M200)、倒置熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE TE2000-U)、氣相色譜-質譜儀(Agilent GC7890A-MS5975C)。尼羅紅(Nile Red)購自J & K Scientific公司, 以丙酮為溶劑配制成 0.1 g/L母液, 于–20℃避光保存。

1.3 實驗方法

微藻的尼羅紅染色 用血球計數板法測定藻細胞密度, 取1 mL細胞密度約為1×106cells/mL的藻液于小試管中, 添加0.01 mL尼羅紅母液使其終濃度為1 mg/L, 振蕩混勻, 于20℃避光染色10min, 用倒置熒光顯微鏡(藍光激發)觀察藻細胞內被染色油脂; 取96孔板, 每孔加入200 μL染色藻液, 用多功能酶標儀檢測激發波長為480 nm時藻液在580 nm處的熒光強度, 并扣除未染色藻液在該波長處的熒光強度即為凈熒光值, 染色處理組和空白對照組均設置3個平行, 重復測定3次。

單細胞熒光值和油脂含量關系的建立 在1.1培養條件下于不同生長階段分別測定藻液熒光強度和細胞密度, 并離心收集藻體, 冷凍干燥至恒重, 取0.1 g干藻粉采用三氯甲烷-甲醇提取法測定總脂含量(%細胞干重)。將單細胞熒光強度和總脂含量進行線性擬合獲得二者線性關系。

不同培養條件下油脂動態積累的檢測 不同氮濃度(以硝酸鈉為氮源)、光照強度、溫度等培養條件列于表1中, 其他培養條件同1.1。將處于指數生長期的藻液按照10%的接種量分別接種到不同培養條件的f/2海水培養基中, 每隔一天測定藻細胞密度和熒光強度, 并由上述所得線性關系計算總脂含量。

表1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001的不同培養條件

油脂產率的計算與脂肪酸組成的分析 取100 mL藻液, 抽濾于事先稱重的0.45 μm濾膜上, 冷凍干燥后稱重, 并根據上述步驟中所得相應的總脂含量進行計算即可獲得油脂產率。將干藻粉用三氯甲烷-甲醇溶液進行提取, 經過皂化和甲酯化處理后用氣相色譜-質譜儀進行脂肪酸組成分析, 色譜柱型號為HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜條件: 載氣為氦氣, 流速為1 mL/min, 進樣口溫度280℃, 傳輸線溫度為280℃; 升溫程序為: 初溫50℃, 保持2min, 以6℃/min升到300℃, 保持15min; 不分流進樣, 進樣量1 μL。質譜條件: 離子源為EI, 倍增器電壓1200V, 離子源溫度為230℃, 四級桿溫度150℃, Scan方式檢測。

1.4 數據統計

每組實驗設置3個平行, 取平均值作為實驗結果(Mean±SD)。用OriginPro 7.5軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 微藻尼羅紅染色鏡檢結果與單細胞熒光值-總脂含量線性關系

將染色后的藻液用藍光激發于熒光顯微鏡下進行觀察(圖1), 藻細胞整體呈紅色, 細胞內被染色油脂體呈明亮的黃色。經觀察發現, 藻細胞內油脂體的大小和數目隨藻液所處生長階段的不同而有所差異。處于對數生長期的藻細胞其油脂體形狀較小, 直徑約為0.5 μm, 且數目較少。進入穩定期后油脂體逐漸變大, 直徑可達1 μm左右, 數目亦有所增加。

圖1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001經尼羅紅染色后的熒光顯微鏡鏡檢圖

由以上觀察結果可知, 金藻在不同的生長階段其油脂含量有所不同, 經尼羅紅染色后的熒光強度也隨之發生變化。為確定總脂含量與熒光強度之間的關系, 用三氯甲烷-甲醇提取法測定不同生長階段微藻的總脂含量, 并將其與相應的單細胞熒光值進行線性擬合, 可獲得如圖2所示線性擬合圖(2= 0.9572), 油脂含量與單細胞熒光強度具有良好的線性相關性, 單細胞熒光值隨著油脂含量的增加而增大。

2.2 在不同培養條件下微藻生長曲線與總脂動態積累

實驗測定了不同氮濃度、光照強度以及溫度培養條件下金藻的生長曲線以及不同生長階段尼羅紅染色的單細胞熒光強度, 并根據2.1中所得線性關系, 獲得了微藻總脂的動態積累過程。

在不同氮濃度培養條件下, 金藻的生長狀況和總脂動態積累過程均受顯著影響。當氮濃度≤1323 μmol/L時, 藻細胞密度隨著氮濃度的增加而增大, 并在1323 μmol/L培養11d時獲得最大藻密度2.7×107cells/mL; 當氮濃度繼續增加到1764 μmol/L時, 藻細胞密度大幅降低(圖3A)。微藻總脂主要在對數生長期后期以及穩定期積累, 隨著氮濃度從 441 μmol/L增加到1764 μmol/L, 總脂含量逐漸降低, 在培養13d時882 μmol/L的氮濃度可獲得最高總脂含量51.2%; 另外, 不同氮濃度的總脂主要積累期隨氮濃度的增加而依次有所延后, 即隨著藻密度的增加, 氮逐漸被消耗到較低水平時總脂開始積累(圖3B)。

圖2 單細胞熒光值與總脂含量的線性關系(R2 = 0.9572)

光照強度對金藻的生長有較大影響, 但對其總脂的積累影響較小。當光照強度過低[37 μmol/(m2·s)]或過高[148 μmol/(m2·s)]時均不利于微藻的生長, 但隨著藻密度的增加, 藻液透光度降低, 此時高光照強度下的藻密度迅速增大并可獲得最大藻密度2.6×107cells/mL (圖4A)。光照強度對總脂的含量影響較小, 高光照強度時的油脂含量略低于中、低光照強度時的油脂含量(圖4B)。

溫度對金藻的生長狀況和總脂動態積累過程具有顯著影響。當溫度過低(15℃)或過高(35℃)時, 微藻生長緩慢, 可獲得的最大藻細胞密度也遠低于25℃培養條件下的藻密度2.4×107cells/mL (圖5A)。微藻總脂含量隨著溫度的升高逐漸降低, 當溫度為15℃時總脂迅速積累, 并在培養7d時即可獲得最大的總脂含量50.8% (圖5B)。

由微藻總脂的積累趨勢可以看出, 不同培養條件下穩定期的總脂含量均比對數期時有所增加, 但并未像尼羅紅染色鏡檢時油滴的數目和大小所增加的那樣大幅提高, 這可能是因為藻細胞內所含總脂除了以油滴形態存在外, 還以溶解態以及與膜結合的形式等存在。

圖3 不同氮濃度對金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長曲線(A)和總脂積累(B)的影響

2.3 微藻培養條件的優化與結果檢測

由2.2中培養結果可知, 當氮濃度為1323 μmol/L時金藻生長最快, 收獲時藻密度最大, 但總脂含量并非最高; 培養初期以92.5 μmol/(m2·s)的光照強度進行培養, 當藻密度達到約1×107cells/mL時適度提高光照強度有利于收獲更高的藻生物量; 25℃培養時有利于微藻生長, 但總脂積累較緩慢, 15℃培養時總脂積累迅速且含量較高, 但生長緩慢, 所以可先于25℃下培養一段時間獲得一定生物量之后再于15℃下培養5—7d使其總脂得到積累。

為盡可能收獲較高的生物量與總脂含量, 根據金藻在不同培養條件下的生長特征和總脂積累特點, 實驗設計了兩階段培養法對其進行培養(表2)。

對兩階段培養的金藻的藻密度和總脂含量進行檢測(圖6), 將其與常規培養條件[氮濃度1323 μmol/L,光照強度92.5 μmol/(m2·s), 溫度25℃]下的金藻進行比較, 可以看出: 由于溫度的降低, 第二階段微藻的生長略有減緩, 但最終所能收獲的最大細胞密度亦可高達2.5×107cells/mL; 在第二階段, 總脂迅速積累, 培養11d時總脂含量可高達63.3%, 遠高于常規培養時所能達到的最大總脂含量44.2%。將兩階段培養法所能獲得的最大油脂產率和其他不同培養條件下所能獲得的最大油脂產率進行對比(圖7), 可以看出: 當氮濃度為882 μmol/L時可獲得最高油脂產率, 氮濃度繼續增大時油脂產率反而降低; 油脂產率隨光照強度的增大而增大, 當光照強度≥92.5 μmol/(m2·s)時油脂產率不再明顯增大; 當溫度為25℃時可獲得最高油脂產率, 溫度過高或過低都會降低油脂產率; 在未進行培養條件優化前, 金藻的油脂產率普遍在15 mg/(L·d)左右, 經過優化并采用兩階段培養法后其油脂產率大幅提高45%以上, 可高達22 mg/(L·d)。為確定經條件優化后的金藻的油脂成分是否仍具有生產生物柴油的優良特性, 實驗利用GC-MS進一步分析研究了其脂肪酸組成。結果顯示(表3), 相比常規培養時的脂肪酸組成, 優化的兩階段培養法所含的C14:0、C16:0等飽和脂肪酸含量有所降低, C18:1等不飽和脂肪酸含量有所增加, C14-C18系脂肪酸含量并無明顯變化, 均可高達總脂肪酸的88%以上, 保持了其生產生物柴油的優良特性。另外, 不飽和脂肪酸總含量的顯著提高也增加了金藻對保健品開發利用的附加產值。

圖4 不同光照強度對金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長曲線(A)和總脂積累(B)的影響

圖5 不同溫度對金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生長曲線(A)和總脂積累(B)的影響

圖6 普通培養法和兩階段培養法對金藻Isochrysis sp.CCMM5001生長曲線和總脂積累的影響對比

表2 金藻Isochrysis sp.CCMM5001兩階段培養法的培養條件

3 討論

3.1 微藻的尼羅紅熒光染色

本實驗利用尼羅紅對金藻進行染色并測定其熒光強度, 發現該熒光強度與藻細胞內總脂含量呈線性關系, 這與Alonzo和Mayzaud[13]對浮游動物的脂類進行染色后發現其熒光強度與脂類濃度呈線性關系的結果類似。尼羅紅染色受諸多因素影響, 如尼羅紅濃度、染色時間以及藻細胞密度等[17]。Chen,.的研究結果表明, 尼羅紅的終濃度在0.25—2 mg/L之間時, 染色效果較佳, 染色時間則以10min最佳[21]。本研究在之前進行的預實驗中發現, 實驗藻株金藻的藻細胞密度在一定范圍內(0—1.075×107cells/mL)與其熒光強度具有良好的線性關系(2=0.9912), 當藻密度大于1.075×107cells/mL時熒光強度逐漸降低(圖8)。并不是所有微藻都適用于尼羅紅染色, 因為大多數微藻細胞具有細胞壁, 限制了尼羅紅進入藻細胞與脂類結合產生熒光, 如Chen,.對勞氏角毛藻()、赫氏圓石藻()、寇氏隱甲藻()、微綠球藻(sp.)以及小球藻(sp.)等藻類進行尼羅紅染色時發現具有細胞壁的藻細胞很難被有效染色, 而在經過液氮研磨、高溫、甲醇、DMSO、丙酮、乙醇以及異丙醇等各種處理之后藻細胞熒光強度有所增強, 其中以25%的DMSO處理效果最好[21]。本實驗所用的金藻不具有細胞壁, 因此可以直接被尼羅紅染色。

圖7 不同培養條件下金藻Isochrysis sp.CCMM5001的油脂產率

表3 普通培養法和兩階段培養法對金藻Isochrysis sp.CCMM5001主要脂肪酸組成的影響對比

圖8 金藻Isochrysis sp.CCMM5001藻細胞密度對熒光強度的影響

以往尼羅紅對微藻染色的研究只限于通過熒光強度的大小來定性或粗略地描述脂類的相對含量[17—19, 22], 而未見對其絕對含量進行研究的報道。本論文在建立單細胞熒光值與總脂含量線性關系的基礎上, 通過簡單的計算即可獲得微藻在不同培養條件下不同生長階段時總脂的絕對含量, 與傳統的測定絕對含量的化學提取法相比, 該方法操作簡單、所需樣品量少(化學提取法需0.2 g干藻粉), 并可即時監測總脂的動態積累過程, 另外, 多功能酶標儀和96孔板在實驗中的應用也使得同時處理大批量的樣品變得快速可行。

3.2 微藻培養條件的優化

本實驗研究了不同氮濃度、光照強度以及溫度培養條件下金藻的生長狀況和總脂動態積累過程, 并優化了培養條件使其具有最高的油脂產率。研究結果表明, 金藻的細胞密度在一定的氮濃度范圍內隨氮濃度的增加而提高, 這與王學魁等和尹翠玲等的研究結果一致[23, 24]; 當氮濃度繼續增加時細胞密度反而降低, 這可能是由于氮的增加改變了培養液的N/P比, 從而限制了藻細胞的生長。光照強度對微藻生長的影響表現為光照過強或過弱都將限制微藻的生長, 但隨著藻密度的增加藻液透光性降低, 適當增大光照強度更有利于微藻生長。溫度是另一個影響微藻生長的重要因素, 一般而言, 低溫時微藻生命活動不活躍, 生長遲緩, 溫度較高時則生長旺盛, 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳生長溫度為25℃。

不同培養條件對金藻總脂的積累也有明顯的影響。王學魁等認為金藻的總脂含量隨氮濃度的增加而提高[23], 但本實驗的研究結果與其相反, 這可能是氮缺乏導致其他代謝路徑的改變, 從而促進了細胞脂質的合成[25]。孫利芹和楊林濤報道稱金藻在高光照條件下總脂含量會相對提高[26], 但本研究結果顯示高光照強度[148 μmol/(m2·s)]條件下反而不利用總脂的積累, 這可能是因為在培養后期高光照強度條件下的微藻仍處于活躍分裂狀態, 蛋白質和色素等物質的含量相對較高, 而作為儲能物質的脂類含量則相對較低。溫度對微藻總脂積累的影響表現為: 低溫有利于總脂尤其是不飽和脂肪酸的積累, 而高溫時總脂含量則相對較低[27—29], 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳總脂積累溫度為15℃。

從實驗結果可以看出, 微藻最佳生長條件與最佳總脂積累條件并不相符。為了獲取較高的油脂產出, 本實驗首次采用兩階段培養法對金藻sp.CCMM5001進行培養, 即先在最適生長條件下培養一段時間以獲得較大生物量然后調節至最適總脂積累條件以獲得較高的總脂含量, 從而大幅提高了其油脂產率。

4 結論

本實驗利用尼羅紅染色法研究發現了金藻sp.CCMM5001的單細胞熒光強度與其總脂含量具有良好的線性關系, 并通過該方法探索了不同培養條件對金藻生長和總脂積累的影響。結果表明, 最適金藻sp.CCMM5001生長和總脂積累的氮濃度、光照強度以及溫度分別為: 1323 μmol/L、148.0 μmol/(m2·s)、25℃和441 μmol/L、92.5 μmol/(m2·s)、15℃。采用兩階段培養法后總脂含量和油脂產率都大幅提高, 可分別高達63.3%和22 mg/(L·d)。

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Research on the dynamic accumulation of lipids insp. CCMM5001 based on the lipid analysis by Nile Red method

Zhou Wen-jun1, Zheng Li1, Han Xiao-tian2, Zheng Ming-gang1, Zhang Kui-ying1, Gao Wei1and Cui Zhi-song1

(1. Research Center for Marine Ecology, the First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China; 2. Key Laboratory of Marine Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266060, China)

Some species of microalgae are considered as an ideal resource for biodiesel production because they contain high level of lipids. The traditional method to quantify the lipids level includes the solvent extraction and gravimetric determination based on a chloroform-methanol-water system. This method has the disadvantage of being time consuming and inefficient. Here we used Nile Red, a lipid-soluble fluorescent probe, to establish a novel method to determinate the level of lipids in microalgae rapidly and accurately. We applied the Nile Red method to investigate the dynamic accumulation of lipids insp.CCMM5001 under different culture conditions. The results showed that there was a linear correlation between the lipids level and the cellular fluorescence of stained microalgal cells, therefore the former can be accurately indicated by the latter. Low nitrogen concentrations and low temperatures were suitable for accumulating of lipids. The level of lipids was reduced if the illumination intensity was overly high or low. On one hand the optimal conditions for the growth were: N concentration at 1323 μmol/L, illumination intensity at 148.0 μmol/(m2·s), and the temperature at 25℃. On the other hand for the maximal accumulation of the lipids, the optimal values of the parameters above were 441 μmol/L, 92.5 μmol/(m2·s), and 15℃ respectively. The culture condition was optimized and a two-stage cultivation was carried out to increase both the level and the production rate of lipids, the former reaching a high concentration of 63.3% and the latter reaching 22 mg/(L·d).

sp; Nile red; Total lipicls; Fluoresence intensity; Growth Curve

2013-01-21;

2013-12-16

海洋公益性行業專項項目(200805039); 海洋可再生能源專項(GHME2001SW02); 國家自然科學基金(41076108, 41106148, 30870247); 山東省科技發展計劃(2011GHY11533)資助

周文俊(1987—), 男, 甘肅武威人; 碩士; 主要從事海洋微藻生物燃料的研究。E-mail: 86zwj@163.com

鄭立, 副研究員, 博士; E-mail：zhengli@fio.org.cn

Q949.2; Q-33

A

1000-3207(2014)02-0312-08

10.7541/2014.45