精索靜脈曲張引起大鼠生殖功能改變及睪丸HSP90α表達變化

韓俊嶺　孔曉君　李建遠

【摘要】 目的 探討精索靜脈曲張后大鼠生殖功能的變化和睪丸中熱休克蛋白90α（HSP90α）的表達變化及規律。方法 將32只SD大鼠隨機分成4組：對照組和3個精索靜脈曲張組（造模成功后第1、3、6周）。分別測定各組大鼠的相應臟器指數，檢測精子相關指標、睪丸中HSP90α的表達。結果 精索靜脈曲張后，大鼠附睪指數在1、3周時顯著低于對照組；精子活力1、3、6周組顯著低于對照組，精子畸形率在1周3周時間點明顯高于對照組，而1、3周時間點精子存活率顯著低于對照組，其他試驗組與對照組相比無顯著差異；1、3、6周組睪丸中HSP90α的表達均顯著高于對照組（P<0.05）。結論 精索靜脈曲張可引起大鼠生殖系統損傷以及睪丸中HSP90α的高表達，提示HSP90α可能保護機體在靜脈曲張狀態下受到的損傷。

【關鍵詞】 精索靜脈曲張；熱休克蛋白90α；生殖；大鼠

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.05.001 文章編號：1004-7484（2014）-05-2405-02

Varicocele causes an Alteration of Reproductive function and Induction of HSP90α Expression in testis of Rat

【Abstract】 Objective To investigate the changes of reproductive function and Hsp90α gene expression in reproductive system of rat with varicocele.Methods Healthy 32 SD rats were randomly divided into 4 groups：control group and 3 varicocele group（1，3 and 6w after varicocele）.Organ index and HSP90α gene expression in testicle were determined.Result At 1 and3w the epididymis index was significantly lower than it in the control；sperm motility rate is significantly lower than the control group at 1，3w and 6w（P<0.05），Sperm deformity and morality rate were significantly higher than the control group at 1 and 3w（P<0.05）.Gene expression of HSP90α in testicle was significantly higher than those in the control group at1，3 and 6w group（P<0.05）.Conclusion Varicocele resulted in the damage of reproductive system，and the increased expression of HSP90α gene in testicle.The increased expression of HSP90α gene may protect cells from varicocele damage.

【Key words】 Varicocele；Heat shock protein90α；Reproduction；Rat

男性不育癥已經成為一個全球性問題，其中精索靜脈曲張是引起男性不育的最常見原因之一，研究發現成年男性中約有2%-22%的人發病，在指標異常的患者中，精索靜脈曲張的患病率為25%-40%[1]。現已證明曲張可引起臨床上睪丸萎縮、精子產生不足以及生育力下降，但精索靜脈曲張引起生殖功能異常的機制尚未完全闡明[2]。HSP90α主要存在于大腦和睪丸中[3]。因此，了解精索靜脈曲張后睪丸中HSP90α表達的改變具有重要意義。本實驗以HSP90α和生殖功能的關系為切入點，探討精索靜脈曲張發生的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 實驗所用青春期雄性SD大鼠32只，6周齡，體重170-220g，SPF級。由濱州醫學院動物實驗中心提供。全自動精子分析儀采用美國漢密爾頓（IVOS-CASA）系統。實驗中所用化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法 將32只SD大鼠隨機分為正常對照組和精索靜脈曲張組。各組造模成功后再按1、3、6周隨機分成3個亞組，每組8只大鼠。模型制備參考劉建軍等[4]的方法，行腹部正中切口，在精索靜脈內側、下腔靜脈外側及左腎靜脈下鈍性分離出一個開口，結扎左腎靜脈，使左腎靜脈直徑縮小約50%。對照組大鼠暴露左腎靜脈過程相同，但不結扎。各亞組大鼠分別于精索靜脈曲張后1、3、6周予斷頸處死，取左側睪丸、附睪及前列腺稱重，用于計算臟器系數，之后用多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片，用于組織學研究。右側睪丸取一部分組織提取RNA，用作PCR檢測。右側附睪用于制備精子懸液，檢測精子相關指標。

1.3 檢測項目

1.3.1 睪丸、附睪及前列腺質量指數 質量系數公式為：質量指數=器官質量（mg）/大鼠質量（g）。

1.3.2 精子活力、活率、畸形率檢測 取出附睪，收集精液并置于37℃環境中。用全自動精子分析儀檢測精子的相關指標。累計檢測400個精子，計算精子的總活力。用相差顯微鏡計數400個精子，計算存活率。用高倍鏡順序計數400個精子并檢查精子形態，計數結構完整精子數。

1.3.3 睪丸中HSP90α基因的RT-PCR檢測 提取睪丸中的RNA，逆轉錄后對HSP90α基因和β-actin進行PCR擴增，采用凝膠成像系統拍照并進行光密度分析。

1.4 統計學方法 數據中計量資料采用Mean±s表示，運用統計軟件SPSS18.0進行處理分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 精索靜脈曲張對大鼠臟器指數的影響 各組大鼠的睪丸、附睪及前列腺質量指數結果，見表1。結果顯示1、3周組的附睪指數與對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）。

表1 精索靜脈曲張后大鼠臟器指數的變化（Mean±SD，n=8）

2.3 精索靜脈曲張對大鼠睪丸中HSP90α表達的影響 在正常情況下，睪丸組織中HSP90α的表達量較低。精索靜脈曲張造模后，睪丸中HSP90α的表達水平開始升高，在3周達到高峰，見圖1。在1、3、6周組均顯著高于對照組（P<0.05）。

3 討論

精索靜脈曲張能夠影響男性生育功能，該疾病日益引起人們的關注。然而精索靜脈曲張的機制尚不完全清楚，其可以通過多種方式影響到睪丸、附睪的結構和功能。熱休克蛋白普遍存在于原核和真核生物體內，高溫、寒冷、低氧、創傷等均可以引起熱休克蛋白的高表達，其中HSP90可通過維持信號分子蛋白的穩定性，參與細胞內多條信號轉導通路的生理過程，從而協助機體對抗不良環境[5]。

本實驗結果顯示：精索靜脈曲張后大鼠睪丸及前列腺指數均有所下降，但與對照組相比差異無統計學意義，然而附睪指數則顯著降低。該結果可能與他們的組織結構、生理功能不同相關，具體原因和機制需要進一步研究。此外精索靜脈曲張導致大鼠精子的活力明顯下降、畸形率顯著升高，其原因和機制有待進一步分析和研究。

HSP90α是胞內蛋白，與多種損傷密切相關，由于其作用底物與多種細胞信號轉導通路密切相關，且可以作為分子伴侶發揮作用[6]，其生理作用越發引起人們的關注，但在生殖系統中的研究較少，本實驗研究了精索靜脈曲張前、后HSP90α在睪丸中的表達情況，PCR結果顯示精索靜脈曲張前HSP90α在睪丸中的表達相對較弱，精索靜脈曲張后表達量明顯增強，且有時間性。提示在精索靜脈曲張過程中，在不同的時間點HSP90α發揮著對生殖系統的保護作用，具體機制需要做進一步的深入研究。

綜上所述，精索靜脈曲張對雄性SD大鼠的生殖系統造成了損傷。PCR結果表明HSP90α可能參與睪丸中精子的發生與附睪內精子的成熟，對于HSP90α在精索靜脈曲張時所發揮的作用，人們的認識還非常有限。需要做進一步的研究，以便深入地了解精索靜脈曲張和男性不育。

參考文獻

[1] Zhang H J，Xu L，Drake V J，et al.Heat-induced liver injury in old rats is associated with exaggerated oxidative stress and altered transcription factor.Activation[J].FASEB Journal，2003，17：2293-2295.

[2] Vos MJ，Hageman J，Carra S，et al.Structural and functional diversities between members of the human HSPB，HSPH，HSPA，and DNAJ chaperone families[J].Biochemistry，2008，47（27）：7001-11.

[3] 戎成婷，韓俊嶺，杜振寧.HSP90β在小鼠生殖系統中的表達及調控[J].南方醫科大學學報，2013，33（4）：491-495.

[4] 劉建軍，楊宇如，董強.實驗性精索靜脈曲張模型的建立及其對睪丸的影響[J].華西醫學，2006，21（3）：538-539.

[5] Jianxiong Chen，Barbara Meyrick et al.Hypoxia increases Hsp90 binding to eNOS viaPI3K-Akt in porcine coronary artery endothelium.Laboratory Investigation，2004，84（2）：182-190.

[6] Jascur T，Brickner H，Salles-Passador I，et al.Regulation of p21（WAF1/CIP1）stability by WISp39，an Hsp90 binding TPR protein[J].Mol Cell，2005，17（2）：237-249.