基于Diurnal在線軟件分析擬南芥生物節律基因對GABA的響應

向文豪等

摘 要：Diurnal是一個基于網絡的在線分析工具，利用該工具可以得到幾種模式植物基因組范圍內的晝夜和生物鐘節律基因表達的變化規律。這一在線分析軟件是一個可供搜索的數據庫，它提供了幾個基于網絡的界面友好的數據挖掘工具，其結果以一種易于理解的方式呈現。在該研究中首先介紹了這個在線軟件的使用方法，然后分析了幾個擬南芥生物鐘節律基因和開花基因在長日照條件下的表達模型，這些結果可以以圖形和數字的方式下載用于后續的特定研究。結合在線數據，該研究表明，γ-氨基丁酸（GABA在1.0mmol/L）可以改變3個生物鐘核心節律基因（TOC1，CCA1和LHY）的表達模式，這種模式的改變主要是增加了這些基因表達的幅度。

關鍵詞：Diurnal軟件；生物鐘；基因表達；γ-氨基丁酸；擬南芥

中圖分類號 Q94 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）08-24-05

Abstract：Diurnal is a web-based tool for accessing the diurnal and circadian genome-wide expression results of genes from several array experiments conducted on common model plants. The database is searchable and provides access to several user-friendly Web-based data-mining tools with easy-to-understand output. Here we first introduced the method of this online software application and analyzed the model pattern of some circadian clock gene components in the longday growth condition in Arabidopsis. These results can be accessed both graphically and numerically downloaded for further use in a specific study. Combining with the wet-lab experiment，we showed that application of γ-aminobutyric acid（GABA at 1.0 mmol/L）can change the pattern of the 3 core circadian clock gene（TOC1，CCA1 and LHY），mainly increasing the amplitude of the gene expression.

Key words：Diurnal online software；Circadian clock；Gene expression；γ-aminobutyric acid；Arabidopsis

地球的自轉導致了大約24h光暗和溫度的節律性變化。生物在進化過程為適應這一自然環境而進化了一種機制使得自身的生命周期與環境變化周期相一致。因此很多生物體學會了“記憶”時間的軌跡從而更好地利用環境。目前研究人員普遍認為生物體對于時間的“記憶”和使自身生命活動與環境同步的功能是通過內在的生物鐘來實現的，生物鐘使得生物的細胞活動在24h內產生節律性地變化。因此，一般認為，生物鐘是一種將環境信號翻譯成體內的信號使新陳代謝和生理機能發生節律性變化的一種機制。植物的生理和代謝途徑、節律性生長以及營養生長向生殖生長的轉換都受到生物鐘的控制。研究表明，擬南芥中大約12%的基因受控于生物鐘的控制在持續光照下表現出節律性的變化；考慮到各種變化的環境因素，節律性變化的基因比例有可能增加到89%左右[1-2]。這些節律性變化的基因主要受到3個關鍵的生物鐘核心元件基因即TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 （CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）的調節[3]。

基因表達的日變化規律（Diurnal）軟件（http：//diurnal.cgrb.oregonstate.edu/）提供了一個簡易的可視化圖形界面，用于檢索和查看某一基因在晝夜變化中的基因表達變化規律。支撐這一軟件運行的數據主要來自于擬南芥、楊樹和水稻等基因芯片平臺提供的數據庫在圖形界面，用戶可以輸入感興趣的基因編碼或一系列的基因編號（gene identifier），并選擇相應的實驗條件（如長日照、短日照以及是否有溫度的晝夜變化等），研究者就可以查看到這一基因在設定的環境條件下的表達模式，并將這種模式以直觀的圖形界面呈現，圖片可以以幾種不同的格式（如BMP、JEPG、TNG等）進行存儲，用于后續的研究。

γ-氨基丁酸（GABA）在植物的發育中起著重要的作用[4-6]。為探討外源性GABA是否參與了擬南芥生物鐘的調節，本研究在實驗中設置了生物鐘節律研究的Zeitgeber time（ZT）時間，借助于Diurnal在線分析軟件探討了GABA對生物鐘節律基因表達模式的規律。

1 材料和方法

1.1 材料 將Col野生型擬南芥種子種在蛭石上，春化處理后放入溫室培養，22℃，16h光照，8h黑暗（光照時間從早上07∶00開始到晚上23∶00結束）。對7d日齡的幼苗隔天人工分別噴灑清水和1.0mmol/L的GABA，培養3周后進行48h持續光照，從最后一個晝夜循環起開始每4 取材料，直到48h的持續光照時間結束，共取材料3d，取18次，并且將第一次取材時間設為生物鐘節律研究的Zeitgeber time （ZT）的0h，本實驗中ZT0是從上午11∶00開始的，取好的材料迅速放入液氮中，保存在-70℃冰箱備用。endprint

1.2 Real-time PCR分析 取80mg蓮座葉片或花序組織采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（Axygen）提取RNA。取1μg RNA采用TOYOBO的cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈，將得到的cDNA稀釋5倍作為熒光定量PCR的模板。

熒光定量PCR的引物由北京擎科生物技術有限公司合成，擴增片段大小在100～300bp。PCR儀為ABI-7500 Fast，熒光染料為羅氏FastStart Universal SYBR Green Master。20μL反應體系：FastStart Universal SYBR Green Master 10μL，正向引物（25μmol/L） 0.5μL，反向引物（25μmol/L）0.5μL，ddH2O 7μL，cDNA 2μL。采用兩步法進行反應，反應程序為：預變性95℃ 10min，變性95℃ 10s，退火和延伸60℃ 30s，40個循環。以PP2AA3為內參基因，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。實驗所用引物序列如下：PP2AA3-F：5-GCGGTTGTGGAGAACATGATACG-3；PP2AA3-R：5-GAACCAAACACAATTCGTTGCTG-3；TOC1-F：5-TCTTCGCAGAATCCCTGTGAT-3，TOC1-R：5-GCTGCACCTAGCTTCAAGCA-3；CCA1-F：5-CCTTTTACAAACACCGGCTCTT-3；CCA1-R：5-AATCGGGAGGCCAAAATGA-3；LHY-F：5-GGCATTTCCACGCAGATATT；LHY-R：5-GGAAACGCTTGATGAGAGC-3。

1.3 Diurnal軟件的在線分析 Diurnal在線分析軟件的網站如下：http：//diurnal.mocklerlab.org/，其使用操作見下文分析。

2 結果與分析

2.1 軟件的操作需要選擇植物生長模式 植物的生長條件，如蔗糖濃度、光照時間在很大程度上影響到基因的節律性表達。因此在分析基因的節律性表達時首先要確定植物的生長條件（表1）。表1顯示一些最常見的擬南芥培養條件供進行研究時參考，例如，如果是長日照條件下的研究基因的節律性表達，就需要在培養條件中設定16h/8h的光暗恒溫（22℃）循環，3%的蔗糖的瓊脂糖培養（表1）。不同的培養條件需要做出相應的選擇。

2.2 Diurnal圖形界面的設計、特點和操作步驟 Diurnal的布局、字體、配色方案是一個用戶友好的界面。點擊http：//diurnal.mocklerlab.org/登陸在線分析軟件。在這一軟件的主頁，含有Diurnal軟件的簡短介紹（圖1）。此外，在網頁的上方還有工具支持組件的介紹，包括該軟件所整合的軟件如HAYSTACK和Element等，用戶可根據需要進行相應的查看和分析。進入Diurnal主頁后，點擊Get Started或search選項，頁面顯示如下界面（圖1中2），該頁面顯示了一些基本的搜索功能，如在Genome下拉菜單中選擇植物的種屬名字。目前，支持在線分析的數據庫來源于擬南芥、水稻、玉米、楊樹、短柄草和大豆共6種作物的基因芯片數據，其中較為詳盡的是擬南芥的數據資源，研究者在進行分析時應選擇相應的物種。本文以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為例進行分析和研究。在實驗條件欄目中，研究者應在相應的實驗條件中打勾，如長日照（圖1中3），然后再進行后續的操作分析。有些植物的培養條件是在某一條件如持續光照條件（LL）下轉變為另一條件如持續光照的溫度循環（LDHC），其條件就表示為圖1中3。其它培養條件的具體意義請參考網站的詳細介紹，以便做出正確的選擇和參考。

2.3 Dinurnal操作的主要要點 在圖1中3的Identifiers文本框中，輸入需要搜索的基因編號，如At5G61380（下文中的TOC1基因），確定是否需要更改基因表達的cutoff值，系統默認的cutoff值為0.8，當然用戶也可以根據自己的需要來更改這個數值。然后確定是否需要選擇Display Models，然后點擊Submit。顯示的結果包含有2條曲線的圖型和一個表格（圖2），表格總結了實驗條件、時相和擬合最好的基因節律性變化的模式（圖2）。如果在Display models選項中選擇不做選擇（不打勾），實驗的結果將是一條曲線和相應的表格。圖2中，折線圖顯示了一個基因在長日照條件下隨時間變化的曲線，圖中的數據是基于基因芯片的相對表達量的分析。此外，數據的展示還以HAYSTACK組件進行了模型匹配算法（pattern-matching algorithm）的模擬，得出了該基因表達變化的最佳模型。需要指出的是，實時基因的表達值可以通過鼠標的點擊進行查看，此值一般在折線的拐點處顯示。在表格中相位變化的拐點是表達量達到最大值的時刻，圖2中的Rigid表示的是曲線的類型（圖2）。

2.4 基因晝夜節律表達的6種基本的模型 通過HAYSTACK組件的模擬分析，基因的表達模式除Rigid曲線類型外，還有Spike（尖刺狀）、Sine（正弦狀）、Cosine（余弦狀）、box1和box2類型的曲線（圖3）。所有節律性基因表達的模式經過Haystack算法模擬后會適合其中一個模式，顯示了這些基因在晝夜循環過程中基因表達的規律。

2.5 生物鐘核心元件基因表達模式分析 為使結果呈現的比較美觀，有時可以把數據拷貝到excel表格中重新做圖（圖4），但其圖形的類型不變。對于每一個基因來說，實驗條件的不同，其基因表達的晝夜節律呈現不同的曲線類型。

生物鐘節律性基因調節的組件中，假式響應調節蛋白（Pseudo-Response Regulator，PRR） 基因隨晝夜時間的進程依次表達[7]，其先后表達順序為PRR9、PRR7和PRR3，這些基因的表達模式都為Spike模型（圖4A）；在長日照條件下，GIGANTEA（GI）參與了擬南芥的開花誘導，在轉錄水平上，GI也可以以一種不依賴于光周期的途徑誘導CONSTANS（CO）的轉錄[8]，而CO是控制開花的一個關鍵因子[9]。LUX（LUX ARRHYTHMO，也稱為PHYTOCLOCK 1）是一個含單一MYB結構域SHAQYF的轉錄因子，它可以和EARLY FLOWERING 3（ELF3）和EARLY FLOWERING 4（ELF4）形成復合體來控制下胚軸的節律性生長[10]。分析顯示，在長日照條件下，GI的表達模式為Spike模型，而Lux的表達模式正弦模式（圖4B），CO的表達模式為余弦模式（圖4C）；CCR2（cold，circadian rhythm，and RNA binding 2）是一個富含甘氨基酸的RNA結合蛋白，它可以反饋調節生物鐘節律振蕩和其自身的基因表達。其表達受到冷脅迫的誘導[11]。分析表明，在長日照條件下CCR2的表達為box模式（圖4D）。其它的基因表達模式在此不做一一介紹。endprint

2.6 GABA參與的生物鐘節律的基因表達分析 在課題研究中，我們以長日照條件培養擬南芥。以培養基中添加GABA作為處理，每4h進行樣品的采集。以熒光定量PCR進行基因表達的定量分析，根據RT-PCR計算的倍率變化，將數據統計在excel表格中，以在線分析的圖形數據為參照，計算GABA處理后的表達變化，然后作圖與對照進行比較，可以歸納出GABA對生物鐘調控的規律。TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY）編碼的轉錄因子是生物鐘節律中3個重要的核心元件，它們交互調節生物節律的功能輸出[12-13]。在長日照條件下3個生物鐘核心元件基因的表達模式為Rigid模型（圖5中的實線部分）。在外施GABA（1.0 mmol/L）條件下，與對照相相比，生物鐘3個核心元件基因的表達模式發生了明顯變化，基因表達的幅度明顯高于對照（圖5中的虛線部分）。

3 討論

以網絡為依托的含有基因表達數據的數據庫和基因芯片的分析工具為植物學研究提供了許多寶貴的資源。其中，Diurnal軟件工具包含了將近228 000個擬南芥晝夜節律和生物鐘節律的基因表達。這些結果來自于Michael、Mockler和Breton等人對擬南芥11個2d時間（大約12點時間點）進程的132個基因芯片（Affymetrix microarrays）的數據比較，用HAYSTACK組件的336個模型對這些基因的表達進行擬合。這一網絡資源提供了一個可供搜索的圖形界面，同時也可以對基因的啟動子元件進行分析。研究表明，生物鐘核心元件的基因表達規律極易受到周圍環境的影響[14]，如植物生長過程中培養中添加蔗糖可以改變生物鐘節律表達的模式[15]。目前的數據證明了GABA的使用可以重新設置生物鐘的振蕩頻率，這也許是導致GABA處理后植物表型變化的本質所在，這一有趣的工作尚需深入進行研究。

參考文獻

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[8]Sawa M，Kay SA. GIGANTEA directly activates flowering locus T in Arabidopsis thaliana[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011；108（28）： 11 698-11 703.

[9]Song YH，Smith RW，To BJ，et al. FKF1 conveys timing information for CONSTANS stabilization in photoperiodic flowering[J]. Science，2012，336（6084）： 1 045-1 049.

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[11]Jarillo JA，Capel J，Tang RH，et al. An Arabidopsis circadian clock component interacts with both CRY1 and phyB[J]. Nature ，2001，410（6827）：487-490.

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[13]Lau OS，Huang X，Charron JB，et al. Interaction of Arabidopsis DET1 with CCA1 and LHY in mediating transcriptional repression in the plant circadian clock[J]. Mol Cell ，2011，43（5）： 703-712.

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[15]Haydon MJ，Mielczarek O，Robertson FC，et al. Photosynthetic entrainment of the Arabidopsis thaliana circadian clock[J]. Nature ，2013，502（7473）：689-692. （責編：施婷婷）endprint

2.6 GABA參與的生物鐘節律的基因表達分析 在課題研究中，我們以長日照條件培養擬南芥。以培養基中添加GABA作為處理，每4h進行樣品的采集。以熒光定量PCR進行基因表達的定量分析，根據RT-PCR計算的倍率變化，將數據統計在excel表格中，以在線分析的圖形數據為參照，計算GABA處理后的表達變化，然后作圖與對照進行比較，可以歸納出GABA對生物鐘調控的規律。TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY）編碼的轉錄因子是生物鐘節律中3個重要的核心元件，它們交互調節生物節律的功能輸出[12-13]。在長日照條件下3個生物鐘核心元件基因的表達模式為Rigid模型（圖5中的實線部分）。在外施GABA（1.0 mmol/L）條件下，與對照相相比，生物鐘3個核心元件基因的表達模式發生了明顯變化，基因表達的幅度明顯高于對照（圖5中的虛線部分）。

3 討論

以網絡為依托的含有基因表達數據的數據庫和基因芯片的分析工具為植物學研究提供了許多寶貴的資源。其中，Diurnal軟件工具包含了將近228 000個擬南芥晝夜節律和生物鐘節律的基因表達。這些結果來自于Michael、Mockler和Breton等人對擬南芥11個2d時間（大約12點時間點）進程的132個基因芯片（Affymetrix microarrays）的數據比較，用HAYSTACK組件的336個模型對這些基因的表達進行擬合。這一網絡資源提供了一個可供搜索的圖形界面，同時也可以對基因的啟動子元件進行分析。研究表明，生物鐘核心元件的基因表達規律極易受到周圍環境的影響[14]，如植物生長過程中培養中添加蔗糖可以改變生物鐘節律表達的模式[15]。目前的數據證明了GABA的使用可以重新設置生物鐘的振蕩頻率，這也許是導致GABA處理后植物表型變化的本質所在，這一有趣的工作尚需深入進行研究。

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[15]Haydon MJ，Mielczarek O，Robertson FC，et al. Photosynthetic entrainment of the Arabidopsis thaliana circadian clock[J]. Nature ，2013，502（7473）：689-692. （責編：施婷婷）endprint

2.6 GABA參與的生物鐘節律的基因表達分析 在課題研究中，我們以長日照條件培養擬南芥。以培養基中添加GABA作為處理，每4h進行樣品的采集。以熒光定量PCR進行基因表達的定量分析，根據RT-PCR計算的倍率變化，將數據統計在excel表格中，以在線分析的圖形數據為參照，計算GABA處理后的表達變化，然后作圖與對照進行比較，可以歸納出GABA對生物鐘調控的規律。TIMING OF CAB1（TOC1），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY）編碼的轉錄因子是生物鐘節律中3個重要的核心元件，它們交互調節生物節律的功能輸出[12-13]。在長日照條件下3個生物鐘核心元件基因的表達模式為Rigid模型（圖5中的實線部分）。在外施GABA（1.0 mmol/L）條件下，與對照相相比，生物鐘3個核心元件基因的表達模式發生了明顯變化，基因表達的幅度明顯高于對照（圖5中的虛線部分）。

3 討論

以網絡為依托的含有基因表達數據的數據庫和基因芯片的分析工具為植物學研究提供了許多寶貴的資源。其中，Diurnal軟件工具包含了將近228 000個擬南芥晝夜節律和生物鐘節律的基因表達。這些結果來自于Michael、Mockler和Breton等人對擬南芥11個2d時間（大約12點時間點）進程的132個基因芯片（Affymetrix microarrays）的數據比較，用HAYSTACK組件的336個模型對這些基因的表達進行擬合。這一網絡資源提供了一個可供搜索的圖形界面，同時也可以對基因的啟動子元件進行分析。研究表明，生物鐘核心元件的基因表達規律極易受到周圍環境的影響[14]，如植物生長過程中培養中添加蔗糖可以改變生物鐘節律表達的模式[15]。目前的數據證明了GABA的使用可以重新設置生物鐘的振蕩頻率，這也許是導致GABA處理后植物表型變化的本質所在，這一有趣的工作尚需深入進行研究。

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[15]Haydon MJ，Mielczarek O，Robertson FC，et al. Photosynthetic entrainment of the Arabidopsis thaliana circadian clock[J]. Nature ，2013，502（7473）：689-692. （責編：施婷婷）endprint