藍莓米酒中總花色苷含量的測定

張采　沈曉同

摘 要：采用消光系數和pH示差2種方法對自制藍莓米酒中總花色苷含量進行測定，測定值分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，消光系數法所測值略小于pH示差法，后者操作難度比前者大。建議相關產品研發時可選用較為簡便的消光系數法，最終產品選用較為準確的pH示差法。

關鍵詞：藍莓米酒；花色苷；pH示差法；消光系數法

中圖分類號 TS26 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）08-163-03

Abstract：Total anthocyanin content in blueberry rice wine was determined by the extinction coefficient and pH-differential methods，measured values ??were 16.82（±0.36）mg/100mL and 17.48（±0.40）mg/100mL. Both methods were more accurate reflection of the sample concentration in the solution of the system. The content tested by extinction coefficient was slightly smaller than the pH-differential method，the latter operation was more difficult than the former. We suggested product development time can be used extinction coefficient method，it was more simple，and the final product selected pH-differential method，it was more accurate.

Key words：Blueberry rice wine；Anthocyanin；pH-differential method；Extinction coefficient method

藍莓（blueberry）屬杜鵑花科越橘屬的一種，多年生落葉或常綠灌木。其果實為漿果，呈深藍色，披白霜，近圓形，皮薄籽小，具有極高的營養價值[1]。藍莓果實中花青素含量極高，花青素與糖以糖苷鍵結合形成花色苷（Anthocyanin），花色苷是以黃酮核為基礎的一類物質中能呈現紅色的一族化合物[2]。近30a間，關于藍莓花色苷具有的抗氧化作用及其他生物活性的研究報道急劇攀升[3-5]，新開發的產品如雨后春筍般涌現出來，但大多未明確標出功效成分花色苷的含量，消費者在選購時缺乏參考依據。

總花色苷的定量方法主要是根據其光學特性進行分析，包括分光光度法中的色價法、pH示差法、消光系數法[6-7]，另外還有高效液相色譜法等。高效液相色譜法定量測定花色苷含量精確度雖高，但設備儀器較昂貴，需要標準品，且花色苷標準品很不穩定，從而限制了這種方法的廣泛使用；色價法是花色苷的百分比值，不能準確表示溶液的濃度含量。本研究旨在比較pH示差法和消光系數法測定自主研發的藍莓米酒產品總花色苷的差異，從而為其他產品花色苷的測定提供參考。

1 儀器與試劑

UV-1801紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；LD4-2A型低速離心機：北京雷勃爾有限公司；EL204電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；95%乙醇、氯化鉀、醋酸、醋酸鈉、鹽酸均為分析純。藍莓米酒由蘇州市職業大學發酵食品實驗室自釀。

2 方法

2.1 藍莓米酒發酵工藝

2.2 試劑配制 1.86g/L的鹽酸-氯化鉀緩沖液（pH=1.0）；54.43g/L的鹽酸-醋酸鈉緩沖液（pH=4.5）；酸化乙醇（95%乙醇-1.5mol/L鹽酸體積比85∶15）。

2.3 樣品制備 移取適量10mL藍莓米酒原液用酸化乙醇定容至50mL，室溫靜置過夜后4 000r/min離心10min，過濾，取上清液備用。

2.4 花色苷含量測定

2.4.1 消光系數法[8] 取待測液5mL放入比色管中，用酸化乙醇稀釋至25mL，使其比色測定時吸光度值在0.2～0.7。由于花色苷在紫外波長下的吸收易混淆于其它類黃酮類化合物，故紫外分光光度計在400～800nm波長范圍內掃描，以蒸餾水為參比，在其最大吸收波長處測定待測液的吸光度。花色苷含量計算公式如下：

A=Amax （1）

C（mg/100mL）=[（A×V1）/（98.2×V2）]×100 （2）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；V1：定容體積（mL）×稀釋倍數；V2：樣品體積（mL）；98.2：花色苷平均消光系數。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量，精密度用相對標準偏差來表示。

2.4.2 pH示差法[7，9] 各取2.5mL待測液放入2只比色管中，分別用pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液定容至10mL，避光陰涼處平衡90min。

平衡好的試樣上紫外分光光度計檢測，用蒸餾水作對照，紫外分光光度計在400～800nm波長范圍內掃描，分別測定藍莓米酒花色苷在pH1.0和pH4.5緩沖液中的最大吸收波長和最大吸收波長處的吸光度值。

根據FULEKI T的研究，結合比耳定律，花色苷含量的計算公式：endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；C：樣品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：總稀釋倍數；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量。精密度計算同2.4.1。

3 結果與分析

3.1 消光系數法

3.1.1 最大吸收波長的確定 從圖1可知，直接用酸化乙醇稀釋的藍莓米酒花色苷溶液中，在546nm處有一最大吸收峰，這是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度試驗 表1顯示，在酸化乙醇溶液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得出藍莓米酒原液中花色苷含量為16.82（±0.36）mg/100mL，相對標準偏差（RSD）為1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波長的確定 比較圖2、圖3可知，在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液中，藍莓米酒在526nm左右處有一最大吸收峰。該吸收峰在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液中差值最大。考慮到儀器的波動，確定在最大吸收值526nm和700nm處讀數。

3.2.2 精密度試驗 從表2可知，在所選定的pH值分別為1.0和4.5的緩沖液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得到藍莓米酒原液中花色苷含量為17.48（±0.40）mg/100mL，相對標準偏差（RSD）為1.41%。

4 結論

采用消光系數法和pH示差法測定自制藍莓米酒總花色苷含量，分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，但pH示差法操作難度明顯大于消光系數法，因此建議相關產品研發時可選用較為簡便的消光系數法，最終產品選用較為準確的pH示差法。

參考文獻

[1]錢慧碧，辛秀蘭，張東升，等.溶劑提取藍莓果渣中總黃酮的研究[J].食品工業科技，2010，31（11）：272-274.

[2]宋德群，孟憲軍，王晨陽，等.藍莓花色苷的pH 示差法測定[J].沈陽農業大學學報，2013，43（2）：231-233.

[3]魏國華，呂良偉，邵斌，等.越橘提取物的研究進展[J].中國食品添加劑，2011（4）：139-143.

[4]陳介甫，李亞東，徐哲.藍莓的主要化學成分及生物活性[J].藥學學報，2010，45（4）：422?429.

[5]李穎暢，孟憲軍，孫靖靖，等.藍莓花色苷的降血脂和抗氧化作用[J].食品與發酵工業，2008（10）：44-48.

[6]曹少謙，潘思軼.血橙花色苷研究進展[J].食品科學，2006，09（27）：278-282.

[7]孫婧超，劉玉田，趙玉平，等.pH示差法測定藍莓酒中花色苷條件的優化[J].中國釀造，2011（11）：171-174.

[8]閆亞美，冉林武，曹有龍，等.黑果枸杞花色苷含量測定方法研究[J].食品工業，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.藍莓干酒及藍莓酒渣花色苷提取工藝的研究[D].泰安：山東農業大學，2010. （責編：施婷婷）endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；C：樣品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：總稀釋倍數；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量。精密度計算同2.4.1。

3 結果與分析

3.1 消光系數法

3.1.1 最大吸收波長的確定 從圖1可知，直接用酸化乙醇稀釋的藍莓米酒花色苷溶液中，在546nm處有一最大吸收峰，這是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度試驗 表1顯示，在酸化乙醇溶液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得出藍莓米酒原液中花色苷含量為16.82（±0.36）mg/100mL，相對標準偏差（RSD）為1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波長的確定 比較圖2、圖3可知，在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液中，藍莓米酒在526nm左右處有一最大吸收峰。該吸收峰在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液中差值最大。考慮到儀器的波動，確定在最大吸收值526nm和700nm處讀數。

3.2.2 精密度試驗 從表2可知，在所選定的pH值分別為1.0和4.5的緩沖液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得到藍莓米酒原液中花色苷含量為17.48（±0.40）mg/100mL，相對標準偏差（RSD）為1.41%。

4 結論

采用消光系數法和pH示差法測定自制藍莓米酒總花色苷含量，分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，但pH示差法操作難度明顯大于消光系數法，因此建議相關產品研發時可選用較為簡便的消光系數法，最終產品選用較為準確的pH示差法。

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[6]曹少謙，潘思軼.血橙花色苷研究進展[J].食品科學，2006，09（27）：278-282.

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[8]閆亞美，冉林武，曹有龍，等.黑果枸杞花色苷含量測定方法研究[J].食品工業，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.藍莓干酒及藍莓酒渣花色苷提取工藝的研究[D].泰安：山東農業大學，2010. （責編：施婷婷）endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；C：樣品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：總稀釋倍數；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量。精密度計算同2.4.1。

3 結果與分析

3.1 消光系數法

3.1.1 最大吸收波長的確定 從圖1可知，直接用酸化乙醇稀釋的藍莓米酒花色苷溶液中，在546nm處有一最大吸收峰，這是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度試驗 表1顯示，在酸化乙醇溶液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得出藍莓米酒原液中花色苷含量為16.82（±0.36）mg/100mL，相對標準偏差（RSD）為1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波長的確定 比較圖2、圖3可知，在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液中，藍莓米酒在526nm左右處有一最大吸收峰。該吸收峰在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液中差值最大。考慮到儀器的波動，確定在最大吸收值526nm和700nm處讀數。

3.2.2 精密度試驗 從表2可知，在所選定的pH值分別為1.0和4.5的緩沖液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得到藍莓米酒原液中花色苷含量為17.48（±0.40）mg/100mL，相對標準偏差（RSD）為1.41%。

4 結論

采用消光系數法和pH示差法測定自制藍莓米酒總花色苷含量，分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，但pH示差法操作難度明顯大于消光系數法，因此建議相關產品研發時可選用較為簡便的消光系數法，最終產品選用較為準確的pH示差法。

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[7]孫婧超，劉玉田，趙玉平，等.pH示差法測定藍莓酒中花色苷條件的優化[J].中國釀造，2011（11）：171-174.

[8]閆亞美，冉林武，曹有龍，等.黑果枸杞花色苷含量測定方法研究[J].食品工業，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.藍莓干酒及藍莓酒渣花色苷提取工藝的研究[D].泰安：山東農業大學，2010. （責編：施婷婷）endprint